表面プラズモン共鳴を使用したクロマトグラフィー画分内のアフィニティリガンド浸出および特定の抗体フラグメント濃度の検出と定量化

バイオ医薬品製造プロセス内のクロマトグラフィーステップの迅速な分析は、カラムのパフォーマンスを評価し、質量バランスデータを提供し、収量と回収の正確な計算を可能にするために、しばしば望ましいです。SPR（表面プラズモン共鳴）バイオセンサー（BIACORE）テクノロジーを使用して、FDA（食品医薬品局）承認の生物療法剤の生産に使用されるポリクローナル抗ジゴキシンFABフラグメントを定量化するサンドイッチ免疫測定法を開発しました。結果は、特定のFABがすべてのアフィニティプロセスストリームと、計算された正確な収量および質量バランスデータで定量化される可能性があることを示しています。ヒツジFABとFCを使用した対照実験は、アッセイがDigifabに固有であることを示しています。特に低分子質量リガンドが親和性吸収剤と共有結合されている場合、クロマトグラフィー画分内の潜在的な浸出リガンドの定量化は、技術的に困難な場合があります。DDMA（ジゴキシン - ジカルボクシメトキシルアミン、ジゴキシンアナログ）などのリガンド漏れを評価する典型的な方法には、標識リガンドと比較的複雑で労働集約的な分析技術の使用が含まれます。同じ分析方法を使用して、カラムから浸出または溶出したリガンドを検出するためのアッセイが開発されました。結果は、すべてのクロマトグラフィー画分で浸出リガンドの最小レベルを示しており、浸出DDMAの総レベルは1.52マイクログと計算されます。これは、実験室のアフィニティ列と組み合わせたDDMAの総量の0.01％未満です。本研究で説明されているSPR方法は、特定のポリクローナルFABフラグメントの迅速なインプロセス分析（ポリクローナル混合物内）に適用され、クロマトグラフィーサポートに共有結合した小分子リガンドの漏れを迅速に評価するために適用できます。

Rapid analyses of chromatographic steps within a biopharmaceutical manufacturing process are often desirable to evaluate column performance, provide mass balance data and to permit accurate calculations of yields and recoveries. Using SPR (surface plasmon resonance) biosensor (Biacore) technology, we have developed a sandwich immunoassay to quantify polyclonal anti-digoxin Fab fragments used for the production of the FDA (Food and Drug Administration)-approved biotherapeutic DigiFab. The results show that specific Fab may be quantified in all affinity process streams and accurate yield and mass balance data calculated. Control experiments using sheep Fab and Fc indicate that the assay is specific to DigiFab. The quantification of potential leached ligand within chromatographic fractions may also be technically challenging, particularly when low-molecular-mass ligands are covalently coupled with an affinity absorbent. Typical methods to assess ligand leakage such as DDMA (digoxin-dicarboxymethoxylamine; digoxin analogue) often involve the use of labelled ligands and relatively complex and labour-intensive analytical techniques. Using the same analytical methodologies, an assay to detect leached or eluted ligand off the column was developed. The results indicate minimal levels of leached ligand in all chromatographic fractions, with total levels of leached DDMA calculated to be 1.52 microg. This is less than 0.01% of the total amount of DDMA coupled with the laboratory-scale affinity column. The SPR methods described in the present study may be applicable for the rapid in-process analysis of specific polyclonal Fab fragments (within a polyclonal mixture) and to rapidly assess leakage of small molecule ligands covalently attached to chromatographic supports.