グルタミン酸 - システインリガーゼの触媒サブユニットと修飾子サブユニット間の相互作用

グルタミン酸 - システインリガーゼ（GCL）は、グルタチオン（GSH）生合成経路の速度制限酵素です。この酵素は、触媒サブユニット（GCLC）と調節サブユニット（GCLM）を含むヘテロダイマーです。GCLCのみがL-GAMMA-グルタミル-L-シュステインの形成を触媒する可能性がありますが、GCLMとの結合は、グルタミン酸とATPのK（M）を低下させ、GSH阻害のためにK（I）を増加させることにより酵素活性を高めます。酵素構造機能の関係を特徴付けるために、GCLCとGCLMの間のヘテロダイマー形成、酵母2ハイブリッドシステムを使用してin vivo、アフィニティクロマトグラフィーを使用してin vitroを調査しました。GCLCとGCLMの間の強力かつ具体的な相互作用が両方のシステムで観察されました。削除分析は、GCLCのC末端領域の一部とGCLMのN末端領域の一部を除くほとんどの領域が、相互作用が発生するために必要であることを示しました。選択されたアミノ酸の点変異も、結合活性についてテストされました。GCLC CYS248ALA/CYS249ALAおよびPro158Leu変異酵素は、野生型GCLCと同じGCLMへの結合の強度を示しましたが、触媒活性は劇的に減少しました。結果は、ヘテロダイマー層が一次アミノ酸配列に依存しない可能性があるが、代わりに、両方のタンパク質の三次構造の複雑な形成を伴うことを示唆しています。

Glutamate-cysteine ligase (GCL) is the rate-limiting enzyme in the glutathione (GSH) biosynthesis pathway. This enzyme is a heterodimer, comprising a catalytic subunit (GCLC) and a regulatory subunit (GCLM). Although GCLC alone can catalyze the formation of l-gamma-glutamyl-l-cysteine, its binding with GCLM enhances the enzyme activity by lowering the K(m) for glutamate and ATP, and increasing the K(i) for GSH inhibition. To characterize the enzyme structure-function relationship, we investigated the heterodimer formation between GCLC and GCLM, in vivo using the yeast two-hybrid system, and in vitro using affinity chromatography. A strong and specific interaction between GCLC and GCLM was observed in both systems. Deletion analysis indicated that most regions, except a portion of the C-terminal region of GCLC and a portion of the N-terminal region of GCLM, are required for the interaction to occur. Point mutations of selected amino acids were also tested for the binding activity. The GCLC Cys248Ala/Cys249Ala and Pro158Leu mutations enzyme showed the same strength of binding to GCLM as did wild-type GCLC, yet the catalytic activity was dramatically decreased. The results suggest that the heterodimer formation may not be dependent on primary amino-acid sequence but, instead, involves a complex formation of the tertiary structure of both proteins.