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懸濁液中の大腸菌細胞の細胞質pHおよびペリプラズムpHは、TORAグリーン蛍光タンパク質変異体3*（TORA-GFPMUT3*）およびTetr黄色の蛍光タンパク質の蛍光測定を使用して4秒の時間分解能で観察されました。蛍光強度は、20 mMベンゾ酸を含む細胞懸濁液を使用してpHと相関しており、これは細胞質pHを外部pHと等しくします。外部pHがpH 7.5から5.5に下がると、細胞質pHは10から20秒以内にpH 5.6から6.5に低下しました。迅速な回復は、HCl添加の約30秒後まで発生し、次の5分間で回復が遅くなりました。コントロールとして、KClの添加は蛍光に影響を与えませんでした。5〜10 mmの酢酸またはベンゾ酸の存在下では、外部酸性化からの回復が減少しました。pH 7.0でベンゾ酸を添加すると、細胞質酸性化が生じ、回復が遅いだけでした。TATシステムを介してペリプラズムにエクスポートされたTORA-GFPMUT3*を使用して、ペリプラズムpHが観察されました。融合タンパク質のペリプラズムの位置は、浸透圧ショックがタンパク質の喪失によりペリプラズム蛍光シグナルを大幅に減少させるが、細胞質タンパク質の蛍光に影響を与えなかったという観察によって確認されました。GFPMUT3*蛍光に基づいて、ペリプラズムのpHは、急速酸シフトを含む、テストされたすべての条件下で外部pHに等しくなりました。ベンゾ酸添加は、ペリプラズムpHに影響を与えませんでした。大腸菌の細胞質pHは、あらゆるひずみコンストラクトに適用できる方法を使用して4秒の時間分解能で測定され、ペリプラズムpHを初めて直接測定しました。
懸濁液中の大腸菌細胞の細胞質pHおよびペリプラズムpHは、TORAグリーン蛍光タンパク質変異体3*（TORA-GFPMUT3*）およびTetr黄色の蛍光タンパク質の蛍光測定を使用して4秒の時間分解能で観察されました。蛍光強度は、20 mMベンゾ酸を含む細胞懸濁液を使用してpHと相関しており、これは細胞質pHを外部pHと等しくします。外部pHがpH 7.5から5.5に下がると、細胞質pHは10から20秒以内にpH 5.6から6.5に低下しました。迅速な回復は、HCl添加の約30秒後まで発生し、次の5分間で回復が遅くなりました。コントロールとして、KClの添加は蛍光に影響を与えませんでした。5〜10 mmの酢酸またはベンゾ酸の存在下では、外部酸性化からの回復が減少しました。pH 7.0でベンゾ酸を添加すると、細胞質酸性化が生じ、回復が遅いだけでした。TATシステムを介してペリプラズムにエクスポートされたTORA-GFPMUT3*を使用して、ペリプラズムpHが観察されました。融合タンパク質のペリプラズムの位置は、浸透圧ショックがタンパク質の喪失によりペリプラズム蛍光シグナルを大幅に減少させるが、細胞質タンパク質の蛍光に影響を与えなかったという観察によって確認されました。GFPMUT3*蛍光に基づいて、ペリプラズムのpHは、急速酸シフトを含む、テストされたすべての条件下で外部pHに等しくなりました。ベンゾ酸添加は、ペリプラズムpHに影響を与えませんでした。大腸菌の細胞質pHは、あらゆるひずみコンストラクトに適用できる方法を使用して4秒の時間分解能で測定され、ペリプラズムpHを初めて直接測定しました。
Cytoplasmic pH and periplasmic pH of Escherichia coli cells in suspension were observed with 4-s time resolution using fluorimetry of TorA-green fluorescent protein mutant 3* (TorA-GFPmut3*) and TetR-yellow fluorescent protein. Fluorescence intensity was correlated with pH using cell suspensions containing 20 mM benzoate, which equalizes the cytoplasmic pH with the external pH. When the external pH was lowered from pH 7.5 to 5.5, the cytoplasmic pH fell within 10 to 20 s to pH 5.6 to 6.5. Rapid recovery occurred until about 30 s after HCl addition and was followed by slower recovery over the next 5 min. As a control, KCl addition had no effect on fluorescence. In the presence of 5 to 10 mM acetate or benzoate, recovery from external acidification was diminished. Addition of benzoate at pH 7.0 resulted in cytoplasmic acidification with only slow recovery. Periplasmic pH was observed using TorA-GFPmut3* exported to the periplasm through the Tat system. The periplasmic location of the fusion protein was confirmed by the observation that osmotic shock greatly decreased the periplasmic fluorescence signal by loss of the protein but had no effect on the fluorescence of the cytoplasmic protein. Based on GFPmut3* fluorescence, the pH of the periplasm equaled the external pH under all conditions tested, including rapid acid shift. Benzoate addition had no effect on periplasmic pH. The cytoplasmic pH of E. coli was measured with 4-s time resolution using a method that can be applied to any strain construct, and the periplasmic pH was measured directly for the first time.
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