発現したタンパク質ライゲーションによるEコリリボヌクレオチド還元酵素のR2サブユニットへのフルオロチロシンの部位特異的組み込み

発現したタンパク質結紮（EPL）は、そのNまたはC末端にプローブまたは不自然なアミノ酸の部位固有の取り込みを備えた標的タンパク質の半合成を可能にします。ここでは、EPLを使用した大腸菌リボヌクレオチド還元酵素の小さなサブユニットの残基356にフルオロチロシン（F（N）YS）を組み込むためにラボが開発したプロトコルについて説明します。この手順では、タンパク質の大部分（375のうち1〜353残基）はインテインドメインに融合され、組換え発現によって調製され、チオエステル活性化された切り捨てられた形でタンパク質が得られます。残りのタンパク質である22-merペプチドは、固相ペプチド合成によって調製され、f（n）yが望ま​​しい位置に含まれています。チオエステル活性化R2およびその後の精製への22-MERペプチドのライゲーションは、残基356でF（n）Yを備えた全長R2を生成します。100mgのY356F（N）Y-R2を生成する手順には3〜4か月かかります。

Expressed protein ligation (EPL) allows semisynthesis of a target protein with site-specific incorporation of probes or unnatural amino acids at its N or C termini. Here, we describe the protocol that our lab has developed for incorporating fluorotyrosines (F(n)Ys) at residue 356 of the small subunit of Escherichia coli ribonucleotide reductase using EPL. In this procedure, the majority of the protein (residues 1-353 out of 375) is fused to an intein domain and prepared by recombinant expression, yielding the protein in a thioester-activated, truncated form. The remainder of the protein, a 22-mer peptide, is prepared by solid-phase peptide synthesis and contains the F(n)Y at the desired position. Ligation of the 22-mer peptide to the thioester-activated R2 and subsequent purification yield full-length R2 with the F(n)Y at residue 356. The procedure to generate 100 mg quantities of Y356F(n)Y-R2 takes 3-4 months.