テトラサイクリン誘導性安定HEK293S細胞株におけるヒトブラジキニンB（2）受容体の高レベルの発現と精製

B（2）ブラジキニン受容体は、Gタンパク質結合受容体ファミリーに属します。この重要な治療標的のための新薬の開発には、受容体に関する構造情報が必要です。現在の研究の主な目標は、将来の生物物理学的研究のためにヒトB（2）受容体を過剰発現することでした。異なるタグ付きB（2）受容体を操作し、それらの特性はHEK293S細胞での過渡発現によって評価されました。N末端でヘキサヒスチジンとC末端の非アペプチドでタグ付けされたB（2）受容体は、高発現レベルと保存されたリガンド結合特性のために選択されました。最初に、粗膜タンパク質の60 pmol/mgレベルで構成的に受容体を構成的に発現するHEK293S安定した細胞株を生成しました。しかし、細胞通過による発現レベルの低下により、HEK293Sテトラサイクリン誘導性安定細胞株でB（2）受容体を発現させました。テトラサイクリンおよび酪酸ナトリウムによるB（2）受容体の発現の誘導は、この受容体でこれまでに報告されている最高レベルである膜タンパク質の100pmol/mgのレベルをもたらしました。発現レベルは細胞の通路で安定しており、受容体のリガンド結合およびシグナル伝達特性は変更されていませんでした。受容体は、n-ドデシルベータ-D-マルトシドによる溶解により、ヒドロキシアパタイトと免疫親和性クロマトグラフィーを組み合わせた2段階の精製手順を使用することにより、ほぼ均一性に精製されました。精製された受容体は機能的ではありませんが、この受容体の将来の構造研究への道を過剰に表現する安定した細胞株からの均一性へのB（2）受容体の精製。

The B(2) bradykinin receptor belongs to the G-protein coupled receptor family. Development of new drugs for this important therapeutic target requires structural information on the receptor. The main goal of the present work was to overexpress the human B(2) receptor for future biophysical studies. Different tagged B(2) receptors were engineered and their properties were evaluated by transient expression in HEK293S cells. A B(2) receptor tagged with a hexahistidine at the N-terminus and a nonapeptide at the C-terminus was selected for high expression level and preserved ligand-binding characteristics. First, we generated a HEK293S stable cell line expressing the receptor constitutively at a level of 60pmol/mg of crude membrane protein. However, the decrease of expression level with cell passages led us to express the B(2) receptor in a HEK293S tetracycline-inducible stable cell line. Induction of expression of the B(2) receptor with tetracycline and sodium butyrate led to a level of 100pmol/mg of membrane protein, which is the highest level reported so far for this receptor. The expression level was stable with cell passages and the ligand-binding and signal transduction properties of the receptor were unaltered. The receptor was purified to near homogeneity by solubilization with n-dodecyl-beta-d-maltoside followed by a two-step purification procedure combining hydroxyapatite and immunoaffinity chromatography. Although the purified receptor is not functional, the purification of the B(2) receptor to near homogeneity from a stable cell line overexpressing this receptor pave the way for future structural studies of this receptor.