大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントの二量体Iは、そのDNA結合のモードに関連しています

校正ポリメラーゼに関連すると、DNAプライマー/テンプレートの初期の3 '端には2つの可能なFATEがあります。テンプレート指向の拡張またはシンテティック修復の基質としての適合性に応じて、5'-3 'ポリメラーゼ活性部位に結合し、重合複合体を生成するか、3'-5'エキソヌクレアーゼ部位に結合し、編集を生成します。複雑。この調査では、生化学的技術と生物物理学的手法の組み合わせを使用して、重合および編集錯体の化学量論、熱力学、運動の安定性を調べます。モデルの校正ポリメラーゼとしての大腸菌DNAポリメラーゼI（KF）のクレノウフラグメントをモデルDNA基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチドプライマー/テンプレートとして使用します。重合複合体は、KFを正しくベースペアの（一致した）プライマー/テンプレートと混合することにより生成されますが、編集錯体は、KFと複数の不一致のプライマー/テンプレートを混合することによって生成されます。一致して増殖した不一致のプライマー/テンプレートで実行される電気泳動移動度シフト滴定は、著しく異なる電気泳動パターンを生じさせます。一致したプライマー/テンプレートの場合、KF.DNA複合体はゆっくりと移動するバンドで表されます。ただし、複数の不一致のプライマー/テンプレートの場合、複合体は主に動きの速いバンドで表されます。分析的な超遠心分離測定は、速い動きとゆっくりした動きのバンドがそれぞれ1：1および2：1 kf.DNA複合体に対応することを示しています。蛍光異方性滴定は、KFが一致したプライマー/テンプレートに対してより高い協同性と結合することを明らかにしています。まとめると、これらの結果は、KFがDNAプライマー/テンプレートで二量体化できることを示しており、最初の分子が重合モードでバインドされているときに二量体化が好まれますが、編集モードで結合すると不利な点があります。ポリメラーゼの自己関連は、高忠実度のDNA複製の調整において重要かつまだ未開拓の役割を果たす可能性があることをお勧めします。

Upon associating with a proofreading polymerase, the nascent 3' end of a DNA primer/template has two possible fates. Depending upon its suitability as a substrate for template-directed extension or postsynthetic repair, it will bind either to the 5'-3' polymerase active site, yielding a polymerizing complex, or to the 3'-5' exonuclease site, yielding an editing complex. In this investigation, we use a combination of biochemical and biophysical techniques to probe the stoichiometry, thermodynamic, and kinetic stability of the polymerizing and editing complexes. We use the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I (KF) as a model proofreading polymerase and oligodeoxyribonucleotide primer/templates as model DNA substrates. Polymerizing complexes are produced by mixing KF with correctly base paired (matched) primer/templates, whereas editing complexes are produced by mixing KF with multiply mismatched primer/templates. Electrophoretic mobility shift titrations carried out with matched and multiply mismatched primer/templates give rise to markedly different electrophoretic patterns. In the case of the matched primer/template, the KF.DNA complex is represented by a slow moving band. However, in the case of the multiply mismatched primer/template, the complex is predominantly represented by a fast moving band. Analytical ultracentrifugation measurements indicate that the fast and slow moving bands correspond to 1:1 and 2:1 KF.DNA complexes, respectively. Fluorescence anisotropy titrations reveal that KF binds with a higher degree of cooperativity to the matched primer/template. Taken together, these results indicate that KF is able to dimerize on a DNA primer/template and that dimerization is favored when the first molecule is bound in the polymerizing mode, but disfavored when it is bound in the editing mode. We suggest that self-association of the polymerase may play an important and as yet unexplored role in coordinating high-fidelity DNA replication.