グラム陰性菌の逆遺伝学を改善するための広範な範囲の自殺ベクター：Yersinia EnterocoliticaのBLAA遺伝子の不活性化

グラムバクテリアにおける二重再結合イベントの肯定的な選択を促進する新しい自殺ベクター（PKNG101）が開発されました。複製の条件付き起源（Orir6K）、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（SMR）をコードするストラブ遺伝子、トランスファーの起源（MOBRK2）、スクロース感度を媒介するSACB遺伝子、および複数のクローニング部位が含まれています。マーカー交換変異誘発により、Yersinia EnterocoliticaのBLAA遺伝子を変異させるために使用されました。これを行うために、最初に、20 kDaベータラクタマーゼAをコードするY. enterocolitica染色体DNAの2.5 kbフラグメントである自殺ベクターPKNG101にクローニングされました。次に、LuxABの挿入によりin vitroで変異しました。PKNG105。その後、破壊されたBLAA遺伝子は、2つのステップでの相同組換えにより、Y。Enterocolitica染色体に再導入されました。第一に、大腸菌SM10ラムダピル（PKNG105）にY.腸内膜の株と併用されました。これにより、単一の相同組換えイベントによるPKNG105が染色体に統合されました。SMR用に選択されたトランスジュジュガンは、sACBの産物であるレバンスクラーゼによって触媒されたレバン（有毒化合物）の合成により、ショ糖に敏感でした。2番目のステップでは、最初のステップからの単一のコロニーが抗生物質を奪われた豊富な培地で成長し、野生型の対立遺伝子BLAAを変異体のものに置き換えて、プラスミド媒介性を切除した2番目の交差の発生を可能にしました。染色体からのSACB。このようなBLAA変異体は、5％スクロースを含むTSA培地で成長する能力について選択されました（250語で切り捨てられた要約）

A new suicide vector (pKNG101) that facilitates the positive selection of double recombination events in Gram-bacteria has been developed. It contains a conditional origin of replication (oriR6K), the strAB genes encoding the streptomycin phosphotransferase (SmR), an origin of transfer (mobRK2), the sacB gene mediating sucrose sensitivity, and multiple cloning sites. It was used to mutate the blaA gene of Yersinia enterocolitica, by marker-exchange mutagenesis. To do this, we have first cloned into the suicide vector pKNG101, a 2.5-kb fragment of Y. enterocolitica chromosomal DNA encoding the 20-kDa beta-lactamase A. Gene blaA was then mutated in vitro by insertion of luxAB, which resulted in pKNG105. The disrupted blaA gene was then reintroduced into Y. enterocolitica chromosome by homologous recombinations in two steps. First, E. coli SM10 lambda pir (pKNG105) was mated with strains of Y. enterocolitica. This led to the integration of pKNG105 into the chromosome, by a single homologous recombination event. The transconjugants, selected for SmR, were sensitive to sucrose due to the synthesis of levans (toxic compounds), catalysed by levansucrase, the product of sacB. For the second step, a single colony from the first step was grown in rich medium deprived of antibiotic, allowing the occurrence of a second crossing-over that replaced the wild-type allele blaA with the mutant one, and then excised the plasmid-borne sacB from the chromosome. Such blaA mutants were selected on their ability to grow on TSA medium containing 5% sucrose.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)