蛍光ピリミジンリボヌクレオチドの合成と酵素取り込み

蛍光ピリミジンリボヌクレオシド類似体の合成のための詳細なプロトコルと、転写反応によるRNA鎖への酵素的取り込みについて説明します。フラン修飾リボヌクレオシド三リン酸は、全体的な収量が33％の2つのステップで合成されます。三リン酸をRNAオリゴマーに組み込むことは、DNAテンプレートの量に比べてほぼ225倍増幅されます。この蛍光修飾SSRNAから導出された細菌のrRNAデコード部位（A-Siteとして知られる）は、同種のリガンドであるアミノグリコシド抗生物質との相互作用との結合イベントを積極的に示します。リボヌクレオシド三リン酸の合成の合計時間は約6日であり、ヌクレオシド三リン酸の組み込みと蛍光標識RNAの精製の組み込みは約40時間です。

A detailed protocol for the synthesis of a fluorescent pyrimidine ribonucleoside analogue and its enzymatic incorporation into an RNA strand by transcription reactions is described. Furan-modified ribonucleoside triphosphate is synthesized in two steps with an overall yield of 33%. Incorporation of the triphosphate into an RNA oligomer occurs with nearly 225-fold amplification over the amount of the DNA template. Bacterial rRNA decoding site (known as the A-site) derived from this fluorescently modified ssRNA positively signals a binding event upon interaction with aminoglycoside antibiotics, its cognate ligands. The total time for the synthesis of ribonucleoside triphosphate is approximately 6 days, and that for the incorporation of the nucleoside triphosphate and purification of the fluorescently labeled RNA approximately 40 h.