リン脂質二重層ナノディスクにおけるシトクロムP450 3A4へのリガンド結合：モデル膜の効果

膜結合タンパク質シトクロムP450 3A4（CYP3A4）は、主要な薬物代謝酵素です。CYP3A4によるリガンド結合のほとんどの研究は、現在、モデル膜が存在しない場合、溶液中に行われています。したがって、CYP3A4リガンド結合挙動に対する膜の影響に関する情報はほとんどありません。リン脂質二重層ナノディスクは、高密度リポタンパク質粒子に由来する新規モデル膜系であり、その安定性、単分散性、一貫性が自己組織化によって確保されます。4つのリガンド（6-（p-トルイジーノ）-2-ナフタレンスルホン酸（TNS）、アルファナフソフラボン（ANF）、ミコナゾール、およびブロモクリプチン）のエネルギーを、ナノディスクに組み込まれたCYP3A4に結合します。ナノディスクへのリガンド結合は、環境に敏感なリガンド蛍光と、ナノディスクの足場タンパク質に存在するトリプトファン残基の蛍光におけるリガンド誘発性シフトの組み合わせによって監視されました。CYP3A4活性部位への結合は、ヘムソレットバンド吸収のリガンド誘導シフトによって監視されました。CYP3A4-NANODISCSの活性部位に結合するための解離定数は、TNSで4.0 microM、ANFで5.8 microM、マイコナゾールで0.45マイクロム、ブロモクリプチンで0.45 microMでした。これらの値は、CYP3A4が脂質二重層に組み込まれているため、溶液中のCYP3A4を使用して測定したものとおそらくより生物学的に関連するものです。場合によっては、NanodiscsでCYP3A4を使用した親和性測定値は、溶液値とは大きく異なります。また、CYP3A4と膜へのリガンド結合の間の平衡も研究しました。TNSは、どちらの環境でも著しい好みを示さなかった。ANFは膜に優先的に結合し、ミコナゾールとブロモクリプチンはCYP3A4活性部位に優先的に結合しました。

The membrane-bound protein cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) is a major drug-metabolizing enzyme. Most studies of ligand binding by CYP3A4 are currently carried out in solution, in the absence of a model membrane. Therefore, there is little information concerning the membrane effects on CYP3A4 ligand binding behavior. Phospholipid bilayer Nanodiscs are a novel model membrane system derived from high density lipoprotein particles, whose stability, monodispersity, and consistency are ensured by their self-assembly. We explore the energetics of four ligands (6-(p-toluidino)-2-naphthalenesulfonic acid (TNS), alpha-naphthoflavone (ANF), miconazole, and bromocriptine) binding to CYP3A4 incorporated into Nanodiscs. Ligand binding to Nanodiscs was monitored by a combination of environment-sensitive ligand fluorescence and ligand-induced shifts in the fluorescence of tryptophan residues present in the scaffold proteins of Nanodiscs; binding to the CYP3A4 active site was monitored by ligand-induced shifts in the heme Soret band absorbance. The dissociation constants for binding to the active site in CYP3A4-Nanodiscs were 4.0 microm for TNS, 5.8 microm for ANF, 0.45 microm for miconazole, and 0.45 microm for bromocriptine. These values are for CYP3A4 incorporated into a lipid bilayer and are therefore presumably more biologically relevant that those measured using CYP3A4 in solution. In some cases, affinity measurements using CYP3A4 in Nanodiscs differ significantly from solution values. We also studied the equilibrium between ligand binding to CYP3A4 and to the membrane. TNS showed no marked preference for either environment; ANF preferentially bound to the membrane, and miconazole and bromocriptine preferentially bound to the CYP3A4 active site.