タンパク質架橋剤のスペーサーに適切に配置されたアジドグループは、近接してリジンを容易にマッピングするためのために

近接したアミノ酸残基間の架橋は、3D構造タンパク質のモデルの検証に距離制約を提供する可能性があります。タンパク質分解消化物におけるリンクされたペプチドの識別による架橋のマッピングは、結合に関する情報を保存しながら切断生成物の分離を可能にする切断可能な架橋剤によって促進されます。これらの要件を満たすアミン特異的な架橋剤であるビス（コシニミジル）-3-アジドメチルグルタレート（BAMG）を提示します。BAMG処理シトクロムcからの架橋ペプチド中のトリス（カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）によって2つの平行反応経路が誘導されます。1つの経路は架橋種の切断につながり、もう1つの経路はBAMGのアジドグループが切断のないアミノ基に縮小されます。部分的に加水分解されたBAMGによって修飾された架橋ペプチドとペプチドは、TCEP誘導反応産物の異なるセットを生成します。これらは、逆位相対角クロマトグラフィーによって分離され、質量分析によって識別されて、親化合物の同一性を明らかにします。クロスリンク由来の反応産物を分離して特定できる容易さは、複雑な生物学的集合体の架橋とタンパク質複合体の混合物のマッピングが近い将来に実行可能になる可能性があることを示しています。

Cross-links between amino acid residues in close proximity can provide distance constraints for the validation of models of the 3D structure proteins. The mapping of cross-links by the identification of linked peptides in proteolytic digests is facilitated by cleavable cross-linkers that enable isolation of the cleavage products while preserving information about the linkage. We present an amine-specific cross-linker, bis(succinimidyl)-3-azidomethyl glutarate (BAMG), that fulfils these requirements. Two parallel reaction pathways are induced by tris(carboxyethyl)phosphine (TCEP) in cross-linked peptides from BAMG-treated cytochrome c. One pathway leads to cleavage of the cross-linked species, while in the other the azido group of BAMG is reduced to an amino group without cleavage. Cross-linked peptides and peptides modified by partially hydrolysed BAMG yield distinct sets of TCEP-induced reaction products. These can be isolated by reversed-phase diagonal chromatography and identified by mass spectrometry to reveal the identity of the parent compounds. The ease with which cross-link-derived reaction products can be isolated and identified indicates that the mapping of cross-links in complex biological assemblies and mixtures of protein complexes might become feasible in the near future.