高度に特異的なゲノム編集のための改善された亜鉛フィンガーヌクレアーゼアーキテクチャ

亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）によって駆動されるゲノム編集は、標的遺伝子に組換え二本鎖分裂を導入することにより、高い遺伝子修正効率（> 10％）をもたらします。切断イベントは、DNAを結合して触媒活性ヌクレアーゼ複合体を形成する上でヘテロ二量体化する2つのカスタム設計ZFNを使用して誘導されます。ただし、現在のZFNアーキテクチャを使用して、切断能力のあるホモダイマーは、ターゲット外の切断により安全性または有効性を制限できる形態にもなります。ここでは、この問題を排除する改善されたZFNアーキテクチャを開発します。構造ベースの設計を使用して、ヘテロダイマーとペアになった場合にのみDNAを効率的に切断する2つのバリアントZFNを設計します。これらのZFNは、親のアーキテクチャと同じくらい効率的に天然の内因性遺伝子座を変更しますが、ホモディマー機能が40倍以上減少し、ゲノム全体の切断のレベルがはるかに低くなります。このアーキテクチャは、遺伝子修飾試薬としてのZFNの特異性を改善するための一般的な手段を提供します。

Genome editing driven by zinc-finger nucleases (ZFNs) yields high gene-modification efficiencies (>10%) by introducing a recombinogenic double-strand break into the targeted gene. The cleavage event is induced using two custom-designed ZFNs that heterodimerize upon binding DNA to form a catalytically active nuclease complex. Using the current ZFN architecture, however, cleavage-competent homodimers may also form that can limit safety or efficacy via off-target cleavage. Here we develop an improved ZFN architecture that eliminates this problem. Using structure-based design, we engineer two variant ZFNs that efficiently cleave DNA only when paired as a heterodimer. These ZFNs modify a native endogenous locus as efficiently as the parental architecture, but with a >40-fold reduction in homodimer function and much lower levels of genome-wide cleavage. This architecture provides a general means for improving the specificity of ZFNs as gene modification reagents.