染色体立体構造キャプチャアッセイの定量分析（3C-QPCR）

染色体立体構造キャプチャ（3C）テクノロジーは、数十から数百キロベースペアを含むスケールでin vivoゲノム組織を探索できる先駆的な方法論です。このスケールでのゲノムの折り畳みを理解することは、エンハンサーや絶縁体などの分散した調節要素が遺伝子調節に関与している哺乳類では特に重要です。3Cテクノロジーには、細胞のホルムアルデヒド固定が含まれ、その後、選択されたDNAフラグメントのペアが細胞の集団に架橋される周波数のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースの分析が続きます。架橋周波数の正確な測定には、最良の定量化技術が必要です。最近、リアルタイムのTaqMan PCRテクノロジーを3Cアッセイの分析に適合させ、ゲル電気泳動で分離された臭化エチジウム染色PCR生成物の強度の測定に依存する現在の半定量的3C戦略よりも架橋周波数をより正確に決定する方法をもたらしました。ここでは、この方法の詳細なプロトコルを提供します。これを3C-QPCRと名付けました。予備的な制御と最適化が実行されると、7〜9日で手順全体（3Cアッセイと定量分析）を完了できます。

Chromosome conformation capture (3C) technology is a pioneering methodology that allows in vivo genomic organization to be explored at a scale encompassing a few tens to a few hundred kilobase-pairs. Understanding the folding of the genome at this scale is particularly important in mammals where dispersed regulatory elements, like enhancers or insulators, are involved in gene regulation. 3C technology involves formaldehyde fixation of cells, followed by a polymerase chain reaction (PCR)-based analysis of the frequency with which pairs of selected DNA fragments are crosslinked in the population of cells. Accurate measurements of crosslinking frequencies require the best quantification techniques. We recently adapted the real-time TaqMan PCR technology to the analysis of 3C assays, resulting in a method that more accurately determines crosslinking frequencies than current semiquantitative 3C strategies that rely on measuring the intensity of ethidium bromide-stained PCR products separated by gel electrophoresis. Here, we provide a detailed protocol for this method, which we have named 3C-qPCR. Once preliminary controls and optimizations have been performed, the whole procedure (3C assays and quantitative analyses) can be completed in 7-9 days.