大腸菌グルタミル-TRNA還元酵素によるグルタミン酸認識と水素化物の移動

大腸菌におけるテトラピロール生合成の最初のステップには、TRNA結合グルタミン酸のグルタミル-1RNAレダクターゼ（GLUTR）によるグルタミン酸-1-セミアルデヒドによるNADPH依存性の還元が含まれます。さまざまな基質と酵素バリアントを使用して、in vitroでの基質特異性へのグルタミールTRNAのグルタミン酸部分の寄与を評価しました。予想外に、グルタミンで誤って充電されたTRNA（GLU）が精製された組換えGLUTRの基質であることがわかりました。同様に、同様に予想外に、グルタミン酸側鎖結合（S109A、T49V、R52K）に関与するアミノ酸残基の置換​​またはアルギニン52グルタミン酸相互作用（グルタミン酸54およびヒスチジン99）の安定化は、酵素活性を無効にしませんでした。しかし、ロイシンとリジンによるアミノアシル結合（GLU）へのグルタミン酸酵素相互作用に関与するグルタミン116およびグルタミン酸114に代わるものは、それぞれレダクターゼ活性を廃止しました。したがって、グルタミン酸とTRNA（GLU）の間のエステル結合は、GLUTRによる基質認識の重要な決定因子を表しているのに対し、「バックドア」出口による製品放出の必要性は、アミノの認識にある程度の構造変動性を可能にすることを提案します。酸部分。基質4-ニトロフェニル酢酸を使用したGLUTRバリアントのNADPHの非存在下で発生したエステラーゼ活性の分析により、チオエステル形成のシステイン50の重要な役割が確認されました。最後に、GLUTRバリアントQ116Lはレダクターゼ活性を欠いていることが観察されましたが、エステラーゼ活性は保持されました。構造ベースの分子モデリングは、Glutamine 116がNADPHのニコチンアミド基を配置して、基質への生産的な水素化物移動を可能にする際に重要であることを示しました。したがって、私たちのデータは、大腸菌由来のGLUTRの活性部位残基の明確な機能に関する新しい情報を提供します。

The initial step of tetrapyrrole biosynthesis in Escherichia coli involves the NADPH-dependent reduction by glutamyl-tRNA reductase (GluTR) of tRNA-bound glutamate to glutamate-1-semialdehyde. We evaluated the contribution of the glutamate moiety of glutamyl-tRNA to substrate specificity in vitro using a range of substrates and enzyme variants. Unexpectedly, we found that tRNA(Glu) mischarged with glutamine was a substrate for purified recombinant GluTR. Similarly unexpectedly, the substitution of amino acid residues involved in glutamate side chain binding (S109A, T49V, R52K) or in stabilizing the arginine 52 glutamate interaction (glutamate 54 and histidine 99) did not abrogate enzyme activity. Replacing glutamine 116 and glutamate 114, involved in glutamate-enzyme interaction near the aminoacyl bond to tRNA(Glu), by leucine and lysine, respectively, however, did abolish reductase activity. We thus propose that the ester bond between glutamate and tRNA(Glu) represents the crucial determinant for substrate recognition by GluTR, whereas the necessity for product release by a 'back door' exit allows for a degree of structural variability in the recognition of the amino acid moiety. Analyzing the esterase activity, which occured in the absence of NADPH, of GluTR variants using the substrate 4-nitrophenyl acetate confirmed the crucial role of cysteine 50 for thioester formation. Finally, the GluTR variant Q116L was observed to lack reductase activity whereas esterase activity was retained. Structure-based molecular modeling indicated that glutamine 116 may be crucial in positioning the nicotinamide group of NADPH to allow for productive hydride transfer to the substrate. Our data thus provide new information about the distinct function of active site residues of GluTR from E. coli.