エルマン法の制限：オキシムの存在下でのコリンエステラーゼ活動測定

チオールをアッセイするためのエルマン法は、コリンエステラーゼ活性測定に広く使用されています。コリンエステラーゼ活性は、チオール試薬5,5'-ジチオビス-2-ニトロベンゾ酸（DTNB）とチオコリンの間の反応で形成された5-Thio-2-ニトロベンゾ酸（TNB）イオンの濃度を定量化することにより、間接的に測定されます。コリンエステラーゼによる基質（すなわち、アセチルチオコリン[ATCH]）加水分解。阻害されたコリンエステラーゼの反応因子であるオキシムは、atch（oximolysis）とも反応し、チオコリンと（間接的に）TNBイオンを産生する求核性です。この研究の目的は、atch oximolysisを特徴付けることでした。したがって、チオコリンである生成物の最終濃度を考慮して、異なるpH値でDTNBの存在下で、Oxime（K027およびHI-6）とATCHの間のoxixylysisを測定しました。求核攻撃における酸化イオンの関与を確認するために、時間の経過に伴う酸化イオン吸収の減少を測定することにより、異なるpH値で、DTNBなしでOximesとAtchの間の反応速度を決定しました。K027の酸化イオンは、Hi-6（22m（-1）min（-1））の酸化イオンよりもAtch（306m（-1）min（-1））で14倍速く反応しました。ただし、エルマン法で得られた速度定数は、K027で84m（-1）min（-1）、HI-6で22m（-1）min（-1）でした。我々の結果は、エルマン法を使用してK027で得られた速度が実際にはエルマン反応自体の速度であることを確認しました。これは、特にオキシム反応が特定のpHでのエルマン反応自体よりも速い場合、コリンエステルとのオキシム反応を評価するために、エルマン法を非批判的に使用できないことを示唆しています。

The Ellman method for assaying thiols is widely used for cholinesterase activity measurement. Cholinesterase activity is measured indirectly by quantifying the concentration of 5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) ion formed in the reaction between the thiol reagent 5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) and thiocholine, a product of substrate (i.e., acetylthiocholine [ATCh]) hydrolysis by the cholinesterase. Oximes, reactivators of inhibited cholinesterase, are nucleophiles that also react with ATCh (oximolysis), producing thiocholine and (indirectly) TNB ion. The aim of this study was to characterize ATCh oximolysis. Therefore, we measured the oximolysis between oximes (K027 and HI-6) and ATCh in the presence of DTNB at different pH values, taking into account the final concentration of a product that is thiocholine. To confirm oximate ion involvement in the nucleophilic attack, we also determined the reaction rate between the oximes and ATCh, without DTNB, at different pH values by measuring the decrease in oximate ion absorption over time. The oximate ion of K027 reacted 14 times faster with ATCh (306M(-1)min(-1)) than the oximate ion of HI-6 (22M(-1)min(-1)). However, the rate constants obtained with the Ellman method were 84M(-1)min(-1) for K027 and 22M(-1)min(-1) for HI-6. Our results confirmed that the rate obtained with K027 using the Ellman method is actually the rate of the Ellman reaction itself. This suggests that the Ellman method cannot be used uncritically to evaluate oxime reaction with choline esters, in particular when oximolysis is faster than the Ellman reaction itself at a given pH.