Linear完全な脱シル化ポリエチレニミンを使用したHEK293T細胞の一時的なトランスフェクションによるHIV偽菌の大規模生産のための最適化プロトコル

抗原の供給源として偽糖（PVS）を採用するHIVワクチン戦略には、大量の粒子が必要です。これらは通常、哺乳類細胞の一時的なトランスフェクションと、培養上清からの放出されたPVの精製によって生成されます。トランスフェクションの効率とコストは重要な問題であるため、このレポートでは、高分子量の線形ポリエチレニミン（PEI）および小さな架橋PEIのパネルを採用することによって達成されたトランスフェクション効率を分析し、翻訳で得られたものと比較したものと比較しました。リン酸カルシウムまたは市販の試薬ポリフェクト。いくつかの修正されたPEIを使用して高効率が得られ、これらの安価な試薬によるトランスフェクションは非常に堅牢でした。観察された効率（発現した遺伝子産物の量によって定量化された）は、リン酸カルシウムトランスフェクションより2〜4倍優れており、大規模用途では非常に高価であるpolyfectを使用して達成されたものとほぼ等しくなりました。いわゆる細胞スタックで成長し、特定された最良の試薬であるPEI87をトランスフェクトした293T細胞からのHIV-PVSの大規模生産と精製のための最適化された迅速なプロトコルについては、ここで説明します。0.4mgのビリオン関連HIV-CA/リットル培養上清の範囲の収量で得られた生成されたPVSは、非ウイルスタンパク質による非常に最小限の汚染のみを示し、したがってワクチン接種に適していました。

HIV vaccine strategies which employ pseudovirions (PVs) as the source of antigen require large amounts of particles. These are typically generated by transient transfection of mammalian cells and purification of the released PVs from the culture supernatant. Since efficiency and cost of transfection are key issues, in this report the transfection efficiencies, achieved by employing a panel of high-molecular-weight linear polyethylenimines (PEIs) and small cross-linked PEIs, were analyzed and compared to those obtained by transfections with calcium phosphate or the commercial reagent Polyfect. High efficiencies were obtained using several of the modified PEIs, and the transfections with these inexpensive reagents were very robust. The observed efficiencies (as quantitated by amounts of expressed gene product) were two to four fold superior to calcium phosphate transfection and approximately equal to that achieved using Polyfect which is, however, prohibitively expensive for large scale applications. An optimized and rapid protocol for the large scale production and purification of HIV-PVs from 293T cells growing in so-called cell stacks and transfected with the best reagent identified, PEI87, is described here. The generated PVs, obtained with a yield in the range of 0.4mg virion-associated HIV-CA/liter culture supernatant, exhibited only very minimal contamination with non-viral proteins and were thus suitable for vaccination applications.