ホルムアルデヒド架橋による開始前複合体の in vivo 安定化

翻訳の開始は、小型リボソームサブユニットに関連する三元複合体（TC; ELF2-GTP-MET-TRNA（I）（MET）を含むいくつかの可溶性因子で構成される43S前発明複合体（PIC）の形成から始まります。次のステップでは、mRNAが48SのPICを形成するために募集され、機械全体がAUG開始コドンに遭遇するまでmRNAの5 '非翻訳領域をスキャンし始めます。40Sおよび60Sのリボソームサブユニットを可溶性因子であるモノソームおよびポリソームから分離するための最も広く使用されている方法は、スクロース密度遠心分離（SDC）です。写真は、SDCによって課される力に耐えられない本質的に不安定な複合体であるため、SDC後の40年代のサブユニットとの関連性を検出するために、安定化剤を使用する必要があります。これは、シクロヘキシミド（翻訳伸長阻害剤）で処理された細胞の破壊緩衝液に直接ヘパリン（高度に硫酸化グリコサミノグリカン）を直接加えることで最初に達成されました。ただし、安定化のメカニズムは理解されておらず、さらに、ヘパリンの使用が、溶解時のセル内の43S/48S写真の因子占有率を反映していない人工因子の関連につながる可能性があるという兆候があります。したがって、酵母細胞が破壊される前に、in vivoで40秒のリボソームサブユニットに関連する架橋因子に、ホルムアルデヒド（HCHO）を使用したPIC安定化の代替方法を開発しました。HCHO安定化を使用して得られた結果は、SDC後に43S/48SのPICで検出された因子が、43S/48S PIC構成のリアルタイムのin vivo "Snapshot"を近似していることを強く示しています。この章では、HCHO架橋のプロトコルを詳細に提示し、ヘパリンとHCHOの安定化手順の違いを示します。さらに、さまざまな質問に対処するために使用されるSDCによるPolysomeプロファイルまたはPIC分析を表示するためのさまざまな条件の概要が概説されます。

Translation initiation starts with the formation of the 43S preinitiation complex (PIC) consisting of several soluble factors, including the ternary complex (TC; elF2-GTP-Met-tRNA(i)(Met)), which associate with the small ribosomal subunit. In the next step, mRNA is recruited to form the 48S PIC and the entire machinery starts scanning the 5' untranslated region of the mRNA until the AUG start codon is encountered. The most widely used method to separate 40S and 60S ribosomal subunits from soluble factors, monosomes and polysomes, is sucrose density centrifugation (SDC). Since PICs are intrinsically unstable complexes that cannot withstand the forces imposed by SDC, a stabilization agent must be employed to detect the association of factors with the 40S subunit after SDC. This was initially achieved by adding heparin (a highly sulfated glycosaminoglycan) directly to the breaking buffer of cells treated with cycloheximide (a translation elongation inhibitor). However, the mechanism of stabilization is not understood and, moreover, there are indications that the use of heparin may lead to artifactual factor associations that do not reflect the factor occupancy of the 43S/48S PICs in the cell at the time of lysis. Therefore, we developed an alternative method for PIC stabilization using formaldehyde (HCHO) to cross-link factors associated with 40S ribosomal subunits in vivo before the disruption of the yeast cells. Results obtained using HCHO stabilization strongly indicate that the factors detected on the 43S/48S PIC after SDC approximate a real-time in vivo "snapshot" of the 43S/48S PIC composition. In this chapter, we will present the protocol for HCHO cross-linking in detail and demonstrate the difference between heparin and HCHO stabilization procedures. In addition, different conditions for displaying the polysome profile or PIC analysis by SDC, used to address different questions, will be outlined.