プロピオメラノコルチンのアミノ末端プロレジョンの可能な役割の調査処理および分泌顆粒への標的化における調査

プロオピオメラノコルチン（POMC）は、神経内分泌細胞の調節された分泌経路を標的とするポリタンパク質であり、そこで組織特異的タンパク質分解を受けて副腎皮質皮質ホルモン、ベータリポトロピン、ベータエンドルフィンなどのペプチドを生成します。POMCのプロ領域は、システイン残基2と24および8および20の間に2つのジスルフィド結合を備えた49アミノ酸の長さです。これらのシステイン残基は種全体で保存されています。領域には、既知のホルモン配列が含まれていません。調節された分泌経路へのソートは、分泌タンパク質の構造でエンコードされた信号の標的化を含むと考えられています。本研究では、POMCのプロ領域のNH2末端部分にあるジスルフィドブリッジが、調節された分泌経路へのPOMCのソートに関与する決定要因を維持するために不可欠である可能性を調べました。ブタPOMC cDNAの部位指向および欠失突然変異誘発を使用して、片方または両方のジスルフィドブリッジが破壊された、またはプロレジオンの最初の26アミノ酸残基が削除された変異体を作成しました。変異したPOMC cDNAを運ぶ組換えレトロウイルスを使用して、神経2A細胞に感染しました。感染した細胞で行われた免疫蛍光および免疫電子顕微鏡研究により、顕著で変異したPOMC免疫反応性ペプチドが、細胞拡張の先端で密なコア小胞に局在していることが明らかになりました。感染したNeuro2A細胞から抽出されたPOMC免疫反応性ペプチドの分析は、1つのジスルフィドブリッジが破壊された変異した前駆体（POMC-S2またはPOMC-S8）が、未環状POMCと同じように効率的に保存および処理されることを示しました。対照的に、両方のジスルフィドブリッジが破壊された変異した前駆体（POMC-S2,8）は、未知のPOMCと同程度まで細胞内コンパートメントに蓄積しませんでした。さらに、この変異体は非常に非効率的に処理されており、K+/Ca2+で細胞を刺激すると、NO放出が観察されませんでした。これらの結果は、POMC-S2,8が、未解決の前駆体よりも効率的に規制された分泌経路に入ったことを示唆しています。しかし、POMCの最初の26アミノ酸残基の削除により、前駆体から両方のジスルフィドブリッジが前駆体から除去された場合、切り捨てられた前駆体（POMCデルタ1-26）は、未測定のPOMCとして動作しました。まとめると、我々の結果は、両方のジスルフィドブリッジを含むプロレジョンのNH2末端部分が分離顆粒への分子の標的化に影響を与えることなく削除できることを示しています。ただし、POMCシーケンス全体がNeuro2A細胞で発現する場合、NH2末端領域の適切な折りたたみが効率的な処理とターゲティングに重要である可能性があります。

Proopiomelanocortin (POMC) is a polyprotein which is targeted to the regulated secretory pathway of neuroendocrine cells where it undergoes tissue-specific proteolysis to yield peptides such as adrenocorticotropic hormone, beta-lipotropin and beta-endorphin. The pro-region of POMC is 49 amino acid long with two disulfide bonds between cysteine residues 2 and 24 and 8 and 20. These cysteine residues are conserved across the species. The pro-region contains no known hormonal sequence. Sorting to the regulated secretory pathway is thought to involve targeting signals encoded in the structure of secretory proteins. In the present study, we have examined the possibility that the disulfide bridges located in the NH2-terminal portion of the pro-region of POMC are essential for maintaining a determinant involved in the sorting of POMC to the regulated secretory pathway. Using site-directed and deletion mutagenesis of the porcine POMC cDNA, we created mutants in which one or both disulfide bridges were disrupted or in which the first 26 amino acid residues of the pro-region were deleted. Recombinant retroviruses carrying the mutated POMC cDNAs were used to infect Neuro2A cells. Immunofluorescence and immunoelectron microscopy studies performed on infected cells revealed that the unmutated and mutated POMC-immunoreactive peptides were localized in dense-core vesicles at the tips of cellular extensions. Analysis of the POMC-immunoreactive peptides extracted from the infected Neuro2A cells indicated that the mutated precursors in which one disulfide bridge was disrupted (POMC-S2 or POMC-S8) were stored and processed as efficiently as the unmutated POMC. By contrast, the mutated precursor in which both disulfide bridges were disrupted (POMC-S2,8) did not accumulate in intracellular compartments to the same extent as unmutated POMC. Moreover, this mutant was very inefficiently processed and no release could be observed upon stimulation of the cells with K+/Ca2+. These results suggest that POMC-S2,8 entered the regulated secretory pathway less efficiently than the unmutated precursor. However, when both disulfide bridges were removed from the precursor from the precursor by deletion of the first 26 amino acid residues of POMC, the truncated precursor (POMC delta 1-26) behaved as the unmutated POMC. Taken together our results indicate that the NH2-terminal portion of the pro-region including both disulfide bridges can be deleted without affecting the targeting of the molecule to secretory granules. However, when the entire POMC sequence is expressed in Neuro2A cells, the proper folding of the NH2-terminal region might be important for efficient processing and targeting.