Monoplex/Multiplex after-the-exponential-pcrアッセイとPrimesafeおよび希釈 'n'-goシーケンスと組み合わせた

このプロトコルでは、あらゆる形態のミスプライミングを抑制する新規試薬であるPrimesafeを使用した、単なる拡張（後期）-PCRアッセイのモノプレックスおよび多重線形（後期）-PCRアッセイの設計と実行について説明します。Late-PCRは、二本鎖DNAの効率的な指数増幅のために制限プライマーと過剰なプライマーを使用し、それに続いて1つの鎖の線形増幅を使用する非対称増幅の高度な形態です。各単一鎖のアンプリコンは、リアルタイムまたはエンドポイントで定量的に検出できます。プライマーアニーリングを製品検出から分離することにより、低気温での製品分析を可能にします。あるいは、各単一のストランドは、便利な希釈手順でシーケンスすることができます。増幅されたサンプルは、柱またはスピンを使用せずに個々のシーケンスプライマーで希釈されます。15ペアの無関係なプライマーで構成される単一の多重化後期PCRで生成された15の異なる一本鎖製品を増幅し、シーケンスしました。Dilute-'N'-Goジデオキシシーケンスは、従来の対称PCRを介して生成された二本鎖アンプリコンよりも便利で、より速く、より安価です。Dilute-'N'-Goシーケンス用の後期PCR製品の準備には30秒しかかかりません。

This protocol describes the design and execution of monoplex and multiplex linear-after-the-exponential (LATE)-PCR assays using a novel reagent, PrimeSafe, that suppresses all forms of mispriming. LATE-PCR is an advanced form of asymmetric amplification that uses a limiting primer and an excess primer for efficient exponential amplification of double-stranded DNA, followed by linear amplification of one strand. Each single-stranded amplicon can be quantitatively detected in real time or at end point. By separating primer annealing from product detection, LATE-PCR enables product analysis at low temperatures. Alternatively, each single strand can be sequenced by a convenient Dilute-'N'-Go procedure. Amplified samples are diluted with individual sequencing primers without the use of columns or spins. We have amplified and then sequenced 15 different single-stranded products generated in a single multiplexed LATE-PCR comprised of 15 pairs of unrelated primers. Dilute-'N'-Go dideoxy sequencing is more convenient, faster and less expensive than sequencing double-stranded amplicons generated via conventional symmetric PCR. The preparation of LATE-PCR products for Dilute-'N'-Go sequencing takes only 30 seconds.