ヒスチジンタグ付きタンパク質の非共有、部位特異的ビオチン化

表面、分光プローブ、またはその他の機能ユニットへのタンパク質の部位固有の共役は、生化学的アッセイを実装するための重要なタスクです。ストレプトアビジン - ビオチン相互作用は、タンパク質の検出、定量化、および機能分析のための非常に汎用性の高いツールであることが証明されています。多価キレート剤トリスリロトリ酢酸（Bttris-NTA）に結合したビオチンを使用して、組換えタンパク質の部位固有の可逆的ビオチン化のためのアプローチを開発しました。Hisタグ付きタンパク質へのBttris-NTAの安定した結合が実証されました。これは、イミダゾールの添加により容易に逆転し、溶液中および界面で多用途の共役スキームを可能にします。ゲルろ過実験により、Hisタグ付きタンパク質は、2：1の化学量論でBttris-NTAをドープしたストレプトアビジンに結合することが明らかになりました。さらに、溶液中および表面上のTRIS-NTAと比較して、Hisタグ付きタンパク質に対する結合親和性の増加が、ストレプトアビジンに関連するBttris-NTAで観察されました。これらの結果は、2つの隣接するTRIS-NTA部分と単一のHISタグの効率的な協同的相互作用を示しており、数日間の生涯で非常に緊密な複雑さをもたらします。バイオセンサー表面へのタンパク質の多重化された捕獲、細胞表面標識、およびウエスタンブロット検出を含む、Bttris-NTAのいくつかのアプリケーションを実証します。His-Tag特異的なビオチン化の顕著な選択性と、非常に安定しているが可逆的な複合体は、機能性タンパク質分析のための多くのさらなる用途の基礎を提供します。

Site-specific conjugation of proteins to surfaces, spectroscopic probes, or other functional units is a key task for implementing biochemical assays. The streptavidin-biotin interaction has proven a highly versatile tool for detection, quantification, and functional analysis of proteins. We have developed an approach for site-specific reversible biotinylation of recombinant proteins through their histidine tag using biotin conjugated to the multivalent chelator trisnitrilotriacetic acid (BTtris-NTA). Stable binding of BTtris-NTA to His-tagged proteins was demonstrated, which is readily reversed by addition of imidazole, enabling versatile conjugation schemes in solution as well as at interfaces. Gel filtration experiments revealed that His-tagged proteins bind to streptavidin doped with BTtris-NTA in a 2:1 stoichiometry. Furthermore, an increased binding affinity toward His-tagged proteins was observed for BTtris-NTA linked to streptavidin compared to tris-NTA in solution and on surfaces. These results indicate an efficient cooperative interaction of two adjacent tris-NTA moieties with a single His-tag, yielding an extremely tight complex with a lifetime of several days. We demonstrate several applications of BTtris-NTA including multiplexed capturing of proteins to biosensor surfaces, cell surface labeling, and Western blot detection. The remarkable selectivity of the His-tag-specific biotinylation, as well as the highly stable, yet reversible complex provides the basis for numerous further applications for functional protein analysis.