DRONPA変異体を使用した高速光活性化ローカリゼーション顕微鏡のためのストロボスコピックアプローチ

可逆的な光物理的特性と光洗浄可能な緑色の蛍光タンパク質様蛍光タンパク質Dronpa-2およびdronpa-3の光スイッチスキームは、アンサンブルおよび単一分子蛍光分光法によって調査され、前駆体タンパク質Dronpaのものと比較しました。光に対するより速い応答と、バルクで観察された新しい変異体のより速い暗い回復も、単一分子レベルでも保持されます。単一分子トレースの分析により、前後のスイッチングに関与する経路の効率と速度定数を抽出することができ、変異体をドンパと比較すると重要な違いがあります。私たちは、ベータ・カンによって提供されるタンパク質環境における発色団のより高い立体配座の自由の観点から、結果を合理化します。光物理的パラメーターを完全に理解することで、これらのフォトクロミックタンパク質を使用したカメラベースのサブディフェリション-limitイメージングの取得パラメーターを最適化することができました。Dronpaとその変異体は、個々の蛍光タンパク質を数回局在させることができるため、一般的な広磁場顕微鏡機器を使用した高速光活性化ローカリゼーション顕微鏡（PALM）に役立つことを示しています。同時に2色のストロボスコピック照明を導入することにより、高速手のひらを達成するための新しいアプローチを提供します。

The photophysical properties and photoswitching scheme of the reversible photoswitchable green fluorescent protein-like fluorescent proteins Dronpa-2 and Dronpa-3 were investigated by means of ensemble and single-molecule fluorescence spectroscopy and compared to those of the precursor protein Dronpa. The faster response to light and the faster dark recovery of the new mutants observed in bulk also hold at the single-molecule level. Analysis of the single-molecule traces allows us to extract the efficiencies and rate constants of the pathways involved in the forward and backward switching, and we find important differences when comparing the mutants to Dronpa. We rationalize our results in terms of a higher conformational freedom of the chromophore in the protein environment provided by the beta-can. This thorough understanding of the photophysical parameters has allowed us to optimize the acquisition parameters for camera-based sub-diffraction-limit imaging with these photochromic proteins. We show that Dronpa and its mutants are useful for fast photoactivation-localization microscopy (PALM) using common wide-field microscopy equipment, as individual fluorescent proteins can be localized several times. We provide a new approach to achieve fast PALM by introducing simultaneous two-color stroboscopic illumination.