ニューロンにおける構成的および調節された遺伝子発現のためのデュアルプロモーターレンチウイルスベクター

ニューロン中の外因性タンパク質の効率的な共発現のための遺伝子導入方法は、中枢神経系の分子基盤の理解に向けた重要なツールです。レンチウイルスは、分化したニューロンを含むさまざまな細胞を伝達できるレトロウイルスベクターです。この作業では、ニューロン中の外因性タンパク質の効率的な共発現を可能にするデュアルプロモーターを含むレンチウイルスベクターを生成しました。単一のレンチウイルスベクターでのヒトシナプシンプロモーター/WPREカセットの2つのコピーを挿入することが、周囲のグリア細胞での発現を除外しながら、培養ニューロンにおけるcDNAの堅牢な共発現を指示することを示します。さらに、シナプシンプロモーターによって制御されるテトラサイクリン誘導系（TET-Off）の挿入は、培養ニューロンの導入遺伝子として使用されると、EGFPの緊密に調節された発現をもたらします。この誘導性システムを使用した一次ニューロンの導入により、ドキシサイクリンがない場合、EGFP mRNAレベルが100倍増加します。導入された培養では、ドキシサイクリンの添加時に24時間以内にEGFP転写が阻害されます。ここで開発したウイルスシステムは、単一のレンチウイルスベクターによって媒介されるニューロン固有の調節された発現を提供し、ニューロン機能の研究のための貴重なツールを証明します。

Gene transfer methods for efficient co-expression of exogenous proteins in neurons are crucial tools towards the understanding of the molecular basis of the central nervous system. Lentiviruses are retroviral vectors that can transduce a wide variety of cells including differentiated neurons. In this work, we have generated lentiviral vectors containing dual promoters that allow efficient co-expression of exogenous proteins in neurons. We show that insertion of two copies of a human synapsin promoter/WPRE cassette in a single lentiviral vector directs robust co-expression of cDNAs in cultured neurons, while excluding expression in the surrounding glial cells. Furthermore, insertion of the tetracycline-inducible system (Tet-off) controlled by the synapsin promoter results in tightly regulated expression of EGFP when used as a transgene in cultured neurons. Transduction of primary neurons with this inducible system leads to a 100-fold increase in EGFP mRNA levels in the absence of doxycycline. In transduced cultures, EGFP transcription is inhibited within 24h upon addition of doxycycline. The viral systems we developed here provide neuron-specific and regulated expression mediated by single lentiviral vectors and will prove valuable tools for the study of neuronal function.