抗イディオタイプ抗体模倣親抗原のタンパク質分解機能

IdioTypicネットワークによるSubtilisin Carlsberg Active Centerの機能的イメージングは、エンドペプチダーゼ、アミダゼ、およびエステラーゼ活性を備えた触媒抗イディオタイプ抗体を生成しました。サブチリシンに対するモノクローナル抗体阻害（AB1 5-H4）は、触媒抗イディオティピックAB2 6B8-E12を生成するために、イゴイオタイピックネットワークを導くためのテンプレートとして使用されました。6B8-E12のタンパク質分解活性は、セルフキーンフルオレセイン-BSAコンジュゲートを使用したザイモグラフィーによって実証され、AB2依存性RNase Aの不活性化を検出した結合アッセイで実証されました。6B8-E12によるペプチド基質の切断により、硬化性結合の前後に芳香族残基を好むように、加水分解の異なるパターンが明らかになりました。AB2の触媒活性は、セリンヒドロラーゼのメカニズムベースの阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフッ化物によって阻害されました。5-H4および6B8-E12はクローン化され、大腸菌でシングルチェーン可変フラグメント（SCFV）として生成され、精製されました。アミドール分解およびエステロリティス活性の運動パラメーターは、AB2およびそのSCFV誘導体で類似していた。6B8-E12の抗原特異的部分は、亜ティリシンと一次構造の類似性を持っていませんが、4桁遅い加速度ではあるが、親抗原のタンパク質分解およびアミドリティス機能を模倣しています。6B8-E12 SCFVの検出可能なエンドペプチダーゼ活性の欠如は、触媒活性の一般的な進化に関する興味深い問題を引き起こします。AB1とAB2のIN Silico 3Dモデルは、それぞれ既知の抗侵害抗体およびABZymesとの強い構造的類似性を明らかにしました。これらの結果は、イディオタイピックネットワークがかなりの程度まで、セリンプロテアーゼの触媒装置を再現することができることを示しており、エネルギーを排出するアミド結合加水分解を加速するアブザイムの誘導のための免疫系による酵素活性中心のイメージングの使用をさらに検証することを示しています。

Functional imaging of subtilisin Carlsberg active center by the idiotypic network yielded a catalytic anti-idiotypic antibody with endopeptidase, amidase, and esterase activities. A monoclonal antibody inhibitory to subtilisin (Ab1 5-H4) was employed as the template for guiding the idiotypic network to produce the catalytic anti-idiotypic Ab2 6B8-E12. Proteolytic activity of 6B8-E12 was demonstrated by zymography using self-quenched fluorescein-BSA conjugate and in a coupled assay detecting Ab2-dependent RNase A inactivation. Cleavage of peptide substrates by 6B8-E12 revealed distinct patterns of hydrolysis with high preference for aromatic residues before or after the scissile bond. Catalytic activity of Ab2 was inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride, a mechanism-based inhibitor of serine hydrolases. 5-H4 and 6B8-E12 were cloned, produced in Escherichia coli as single-chain variable fragments (scFvs), and purified. Kinetic parameters for amidolytic and esterolytic activities were similar in Ab2 and its scFv derivative. Although the antigen-specific portion of 6B8-E12 possesses no primary structure similarity to subtilisin, it mimics proteolytic and amidolytic functions of the parental antigen, albeit with 4 orders of magnitude slower acceleration rates. The lack of detectable endopeptidase activity of 6B8-E12 scFv raises interesting issues concerning general evolution of catalytic activity. The in silico 3D models of Ab1 and Ab2 revealed strong structural similarity to known anti-protease antibodies and to abzymes, respectively. These results indicate that the idiotypic network is capable, to a significant extent, of reproducing catalytic apparatus of serine proteases and further validate the use of imaging of enzyme active centers by the immune system for induction of abzymes accelerating energy-demanding amide bond hydrolysis.