細胞培養（SILAC）におけるアミノ酸による安定した同位体標識および5,111タンパク質の深さへのマウス胚性幹細胞のプロテオーム定量

胚性幹（es）細胞は、哺乳類の干渉前胚から分離された多能性細胞です。彼らはすべての細胞タイプに差別化することができ、したがって再生医療で大きな期待を抱いています。ここでは、マウスES細胞は、細胞培養の最後の段階で栽培されたフィーダーを含まないときに標識されるときに、完全にシラック（細胞培養におけるアミノ酸による安定した同位体標識）であることを示しています。1次元ゲル電気泳動とペプチドの等電焦点によって、Silac標識ES細胞プロテオームを分画しました。サブPPM質量精度での線形イオントラップオルビトラップ機器（LTQ-Orbitrap）の高解像度分析により、5,000を超える異なるタンパク質の自信を持って識別され、定量化されました。これは、これまで報告されている最大の定量化されたプロテオームであり、Ras（ERAS）の胚形態とともに、OCT4、Nanog、Sox2、UTF1などの顕著な幹細胞マーカーを含んでいます。また、サイトゾル、核形成、および膜/クロマチン画分に存在するES細胞プロテオームの割合を定量化しました。2つの異なる調製アプローチ、細胞分画に続いて、1次元ゲル分離と総細胞溶解物の等溶液消化と等電気焦点を組み合わせて比較し、いずれかのアプローチの官能性タンパク質クラスに明らかなバイアスを持たない同等のプロテオームカバレッジを発見しました。ES細胞プロテオームのバイオインフォマティクス分析により、増殖に関与するタンパク質の過剰表現を伴う細胞機能の広範な分布が明らかになりました。プロテオームを、ES細胞内のプロモーターのクロマチン状態の最近公開されたマップと比較し、タンパク質発現と活性および抑制クロマチンマークの存在との間に優れた相関が見つかりました。

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells isolated from mammalian preimplantation embryos. They are capable of differentiating into all cell types and therefore hold great promise in regenerative medicine. Here we show that murine ES cells can be fully SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture)-labeled when grown feeder-free during the last phase of cell culture. We fractionated the SILAC-labeled ES cell proteome by one-dimensional gel electrophoresis and by isoelectric focusing of peptides. High resolution analysis on a linear ion trap-orbitrap instrument (LTQ-Orbitrap) at sub-ppm mass accuracy resulted in confident identification and quantitation of more than 5,000 distinct proteins. This is the largest quantified proteome reported to date and contains prominent stem cell markers such as OCT4, NANOG, SOX2, and UTF1 along with the embryonic form of RAS (ERAS). We also quantified the proportion of the ES cell proteome present in cytosolic, nucleoplasmic, and membrane/chromatin fractions. We compared two different preparation approaches, cell fractionation followed by one-dimensional gel separation and in-solution digestion of total cell lysate combined with isoelectric focusing, and found comparable proteome coverage with no apparent bias for any functional protein classes for either approach. Bioinformatics analysis of the ES cell proteome revealed a broad distribution of cellular functions with overrepresentation of proteins involved in proliferation. We compared the proteome with a recently published map of chromatin states of promoters in ES cells and found excellent correlation between protein expression and the presence of active and repressive chromatin marks.