SMN2遺伝子のSMN1への遺伝的変換：脊髄筋萎縮の治療に対する新しいアプローチ

劣性神経筋疾患である脊髄性筋萎縮症 (SMA) は、SMN1 遺伝子の変異または欠失によって引き起こされます。SMN2 遺伝子は染色体 5 の同じ領域に存在し、エキソン 7 の +6 位の T を除いて DNA 配列が SMN1 と類似しています。これが 2 つの遺伝子間の主な機能的違いであると考えられます。この変化により RNA スプライシングが変化し、その結果、成熟 mRNA からエクソン 7 が除去されます。SMN2 遺伝子から生成される完全長転写産物はわずか 10% です。私たちの研究室は、一本鎖オリゴヌクレオチド (ODN) を使用して、天然の染色体の中で 1 塩基変異を持つ遺伝子を修復できることを示しました。ここでは、SMN2 配列特異的な ODN を使用して、1 型患者の SMA 皮膚線維芽細胞株の T から C への交換を指示しました。細胞は長さ47または75塩基のODNでトランスフェクトされ、SMN2遺伝子の転写または非転写DNA鎖のいずれかにハイブリダイズするように設計されました。私たちは、確立された Taqman プローブベースの PCR アッセイ、制限酵素消化、およびサイクルシーケンスを使用して、これらの細胞の遺伝子型を分析しました。特定の ODN を追加すると、SMN2 遺伝子型の SMN1 への変換が検出されました。その結果、qRT-PCR で測定した全長 SMN mRNA、およびウェスタンブロッティングで測定した SMN タンパク質の産生の増加が観察されました。最後に、適切に局在化された SMN タンパク質が、標的細胞内でのみコイル状体 (ジェム) のジェミニの付着によって検出されました。これは、SMA患者由来のヒト細胞においてSMN2からSMN1への遺伝子変換を指示するためのODNの使用に関する最初の報告である。

Spinal muscular atrophy (SMA), a recessive, neuromuscular disease, is caused by a mutation or deletion in the SMN1 gene. The SMN2 gene is present in the same region of chromosome 5 and is similar in DNA sequence to SMN1 except for a T at position +6 of exon 7 that is likely the predominant functional difference between the two genes. This change alters RNA splicing which results in the removal of exon 7 from the mature mRNA; only 10% full-length transcripts are produced from the SMN2 gene. Our lab has shown that single-stranded oligonucleotides (ODN) can be used to repair genes with single base mutations within the context of the native chromosome. Here, we used SMN2-sequence-specific ODNs to direct the exchange of a T to a C in an SMA skin fibroblast cell line from a type 1 patient. The cells were transfected with ODNs of either 47 or 75 bases in length and designed to hybridize to either the transcribed or non-transcribed DNA strand of the SMN2 gene. We analyzed the genotype of these cells using a well-established Taqman probe-based PCR assay, restriction enzyme digestion, and cycle sequencing. Conversion of the SMN2 genotype to SMN1 was detected when the specific ODN was added. As a result, we observed an increase in production of full-length SMN mRNA, measured by qRT-PCR, and SMN protein, measured by western blotting. Finally, properly localized SMN protein was detected by the accretion of gemini of coiled bodies (gems) only in targeted cells. This is the first report of the use of ODNs to direct genetic conversion of SMN2 to SMN1 in human cells from SMA patients.