CFPおよびYFPを使用したエンジニアリングFRETコンストラクト

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）テクノロジーは、さまざまな細胞機能の遺伝的にエンコードされた蛍光指標を開発するために使用されています。ここでは、Aequorea Victoria（CFPとYFP）の緑色蛍光タンパク質（GFP）のシアンと黄色の発光バリアントの間のFRETの構造を設計する方法について説明します。この章を通して、FRETはドナーとアクセプターの間の相対的な向きと距離に非常に敏感であるという事実を強調します。章は2つの部分で構成されています。まず、私たちの研究室で開発された単一遺伝子によってコードされたFRETベースの指標について説明します。このアプローチでは、FRET効率の比較評価のために、さまざまな構成要素を作成できます。たとえば、蛍光タンパク質と宿主タンパク質の間のリンカーの長さと配列は、特定のアプリケーションごとに最適化する必要があります。2番目の部分では、長くて柔軟なリンカーで融合タンパク質を成功させるための一般的かつ効率的なツールの紹介など、エンジニアリングFRETコンストラクトのための長く柔軟なリンカーの使用について説明します。CFPとYFPがフロッピーリンカーを介して互いに相互作用する2つのタンパク質ドメインに融合すると、2つの蛍光タンパク質は、Aequorea GFPの二量体化傾向が弱いため関連します。このアプローチは、FRET用の新しい蛍光タンパク質の組み込みであるサイペットとYPETの構造により、さらに強力になりました。

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) technology has been used to develop genetically encoded fluorescent indicators for various cellular functions. Here we discuss how to engineer constructs for FRET between the cyan- and yellow-emitting variants of green fluorescent protein (GFP) from Aequorea victoria (CFP and YFP, respectively). Throughout this chapter, we stress the fact that FRET is highly sensitive to the relative orientation and distance between the donor and the acceptor. The chapter consists of two parts. First, we discuss FRET-based indicators encoded by single genes, which were developed in our laboratory. In this approach, a number of different constructs can be made for a comparative assessment of their FRET efficiencies. For example, the length and sequence of the linker between the fluorescent protein and the host protein should be optimized for each specific application. In the second part, we describe the use of long and flexible linkers for engineering FRET constructs, including an introduction to a general and efficient tool for making successful fusion proteins with long and flexible linkers. When CFP and YFP are fused through floppy linkers to two protein domains that interact with each other, the two fluorescent proteins will associate due to the weak dimerization propensity of Aequorea GFP, which results in moderate FRET. This approach has become even more powerful due to the construction of a new pair of fluorescent proteins for FRET: CyPet and YPet.