前駆体のリアルタイムPCR定量化および成熟マイクロRNA

miRNA前駆体は安定したヘアピンで構成され、成熟miRNAは標準PCRプライマーのサイズであるため、miRNA（miRNA）はPCRによって増幅するための困難な分子です。これらの困難にもかかわらず、リアルタイムのRT-PCRテクノロジーの成功は、前駆体と成熟したマイクロRNAの両方を増幅および定量化するために開発されてきました。前駆体と成熟マイクロRNAを検出するために当社が開発したリアルタイムPCRテクノロジーの概要をここに示します。プロトコルは、相対（比較c（t））および絶対（標準曲線）の定量化を使用したデータの表示を説明します。リアルタイムPCRアッセイを使用して、リポ多糖によって刺激された単球における前駆体の時間経過と成熟miR-155発現を測定しました。プロトコルは、高スループット遺伝子発現プロファイリング用の低密度PCRアレイとしてアッセイを構成するために提供されます。12-O-Tetradecanoylphobol-13-アセテートと区別するように誘導されるHL60細胞で200以上の前駆体と成熟miRNAをプロファイリングすることにより、分化中に処理が調節されるmiRNAを特定することができました。リアルタイムPCRは、PCRの特異性と感度により、核酸定量のゴールドスタンダードとなっています。技術の進歩により、より伝統的なRNAに匹敵する品質のmiRNAの定量化が可能になりました。

microRNAs (miRNAs) are challenging molecules to amplify by PCR because the miRNA precursor consists of a stable hairpin and the mature miRNA is roughly the size of a standard PCR primer. Despite these difficulties, successful real-time RT-PCR technologies have been developed to amplify and quantify both the precursor and mature microRNA. An overview of real-time PCR technologies developed by us to detect precursor and mature microRNAs is presented here. Protocols describe presentation of the data using relative (comparative C(T)) and absolute (standard curve) quantification. Real-time PCR assays were used to measure the time course of precursor and mature miR-155 expression in monocytes stimulated by lipopolysaccharide. Protocols are provided to configure the assays as low density PCR arrays for high throughput gene expression profiling. By profiling over 200 precursor and mature miRNAs in HL60 cells induced to differentiate with 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate, it was possible to identify miRNAs who's processing is regulated during differentiation. Real-time PCR has become the gold standard of nucleic acid quantification due to the specificity and sensitivity of the PCR. Technological advancements have allowed for quantification of miRNA that is of comparable quality to more traditional RNAs.