インジケーターSBFIを搭載したヒト血小板のサイトゾルフリーナトリウム濃度の静止およびADP誘発変化

1.蛍光インジケーターSBFI（ナトリウム結合ベンゾフラン同性酸）を搭載したヒト血小板で、サイトゾルを含まないNa+濃度[Na+] Iを調査しました。2.血小板懸濁液からのSBFI蛍光は、340および385 nmの励起波長で測定され、340/385 nm蛍光比は[Na+] I in situの観点から較正されました。[Na+] Iは、Na（+）-K+イオノフォア、グラミシジンの存在下で、さまざまな[Na+]の培地で細胞を再懸濁することにより、既知の値に設定されました。3.基礎フリー[Na +] Iは5.5 +/- 0.3 mm（n = 50）でした。これは、総血小板Na+の推定値よりもかなり低く、細胞内Na+が隔離または結合されることを示唆しています。4. ADP（40 microM）は、6.4 +/- 0.7から18.3 +/- 1.1 mm（n = 8）の[Na +] Iの上昇を引き起こしました。[Na+] IのADP誘発の上昇は、外部Na+をN-メチル-D-グルカミンに置き換えたときに廃止されました。これは、[na+] Iの上昇がNa+エントリによるものであったことを示しています。5.蛍光pHインジケーターを搭載した血小板、BCECF、40 microM-ADPは、7.21 +/- 0.03から7.12 +/- 0.03（n = 10）の細胞質pH（PHI）の低下を呼び起こすことが示されました。ADP添加Phiが7.15 +/- 0.03にしか回収されなかった3分後。回復は外部Na+に依存しており、Na（+）-H+交換によって媒介されたことを示唆しています。ただし、これは約0.5 mmの[Na+] Iの増加のみを説明し、ADP誘発Na+侵入のほとんどが他のメカニズムによって発生したことを示しています。6.停止流蛍光測定により、[Na+] IのADP誘発の上昇は、測定可能な遅延なしに開始され、1秒以内にピークに達したことが示されました。したがって、初期動態は、[Ca2+] iでADP誘発上昇について報告された動態と類似していた。7.セル付属のパッチクランプ記録は、ADPがピペット充填ソリューションに含まれると、ADPがシングルチャネルの内向き電流を誘発することを示しました。Ca2+がピペットに存在するか、存在していないかにかかわらず、電流は類似していた。勾配コンダクタンスは、外部Ca2+の存在下では11 ps、その不在は10 psでした。電流と電圧の関係は類似しており、両方の条件下で反転電位は0 mVに近かった。8. SK＆F 96,365（20 microM）は、いくつかの非励起性細胞における受容体を介したCa2+侵入のブロッカーであり、[Na+] iのADP誘発上昇をブロックしました。この化合物は、[Ca2+] Iの二相性ADP誘発の上昇を部分的にブロックすることが示されており、侵入の速い受容体操作期に選択的であることが示されています。9.これらのデータは、ADPがNa+および二重陽イオンに透過性のある血小板血漿膜のチャネルを急速に活性化することを示唆しています。

1. Cytosolic free Na+ concentration, [Na+]i, was investigated in human platelets loaded with the fluorescent indicator SBFI (sodium-binding benzofuran isophthalate). 2. SBFI fluorescence from platelet suspensions was measured at excitation wavelengths of 340 and 385 nm and the 340/385 nm fluorescence ratio was calibrated in terms of [Na+]i in situ. [Na+]i was set to known values by resuspending cells in media with various [Na+], in the presence of the Na(+)-K+ ionophore, gramicidin. 3. Basal free [Na+]i was 5.5 +/- 0.3 mM (n = 50). This is considerably lower than estimates of total platelet Na+, suggesting that much intracellular Na+ is sequestered or bound. 4. ADP (40 microM) evoked a rise in [Na+]i from 6.4 +/- 0.7 to 18.3 +/- 1.1 mM (n = 8). The ADP-evoked rise in [Na+]i was abolished when external Na+ was replaced with N-methyl-D-glucamine. This indicates that the rise in [Na+]i was due to Na+ entry. 5. In platelets loaded with the fluorescent pH indicator, BCECF, 40 microM-ADP was shown to evoke a fall in cytosolic pH (pHi) from 7.21 +/- 0.03 to 7.12 +/- 0.03 (n = 10). Three minutes after ADP addition pHi had only recovered to 7.15 +/- 0.03. The recovery was dependent on external Na+, suggesting it was mediated by Na(+)-H+ exchange. However, this would only account for an increase in [Na+]i of approximately 0.5 mM, indicating most of the ADP-evoked Na+ entry occurred by other mechanisms. 6. Stopped-flow fluorimetry showed that the ADP-evoked rise in [Na+]i commenced without measurable delay and peaked within 1 s. The initial kinetics were thus similar to those reported for ADP-evoked rises in [Ca2+]i. 7. Cell-attached patch-clamp recordings showed that ADP evoked single-channel inward currents when included in the pipette-filling solution. The currents were similar whether Ca2+ was present or absent from the pipette. The slope conductance was 11 pS in the presence of external Ca2+ and 10 pS in its absence. Current-voltage relationships were similar and the reversal potentials were close to 0 mV under both conditions. 8. SK & F 96,365 (20 microM), a blocker of receptor-mediated Ca2+ entry in several non-excitable cells, blocked the ADP-evoked rise in [Na+]i. This compound has been shown to only partly block the biphasic ADP-evoked rise in [Ca2+]i, being selective for the fast, receptor-operated phase of entry. 9. These data suggest that ADP rapidly activates a channel in that platelet plasma membrane which is permeable to Na+ and divalent cations.