生理学的pHおよび温度でのDNAトリプルヘリックス形成

二重DNAとトリプルヘリックスを形成するオリゴヌクレオチドは、in vivoで遺伝子発現を特異的に調節する部位をサイトに提供する新しい方法を提供します。シトシンとチミンの両方を含むホモピリミジンオリゴマーによって形成されたトリプルヘリックスは、酸のpHと低温で安定化されており、pH 7.5と37度Cの両方でこれらのオリゴマーを使用した三葉形成に関する情報はほとんどありません。pH 7.5での三重形成について。サブマイクロモル濃度での30-MERオリゴヌクレオチド（Tおよび5-メチルCで構成された）は、pH 7.5および37度Cでターゲットデュプレックスとトリプレックスを形成しました。約1時間。37度Cでは、21メートルのオリゴマーがターゲットデュプレックスに弱く結合しましたが、25マーと30マーの両方がトリプレックスを容易に形成しました。25度Cでは、21-merが長いオリゴマーと同様に動作したため、この三屈形成と長さの形成と長さの関係は温度依存でした。スペルミン濃度の増加（0.2から1 mm）は、形成される三倍の量を増加させました。スペルミンは、オリゴマーと二重鎖との関連にとってのみ重要である可能性があります。これは、形成されたトリプレックスの後にスペルミン濃度を減少させると、検出されたトリプレックスの量を減らしなかったためです。1 mmのスペルミンでは、トリプルヘリカル複合体の形成はKClの濃度に非常に依存していました。KCLを50 mmから100 mmに増やすと、トリプレックスの形成が防止されました。ただし、KClの阻害効果は、スペルミン濃度を2 mmに上げることで廃止できます。私たちの観察結果は、生理学的条件下でトリプルらせんが形成される可能性があるが、その形成はいくつかの競合する相互作用の影響を受けることを示しています。

Oligonucleotides that form a triple helix with duplex DNA offer a novel way to site specifically regulate gene expression in vivo. Triple helices formed by homopyrimidine oligomers containing both cytosine and thymine are stabilized by acid pH and low temperature, and there is little information about triplex formation with these oligomers at both pH 7.5 and 37 degrees C. Therefore, we examined the effect of changing various conditions on triplex formation at pH 7.5. A 30-mer oligonucleotide (composed of T and 5-methyl C) at submicromolar concentrations formed a triplex with its target duplex at pH 7.5 and 37 degrees C. Association of the 30-mer oligomer with the duplex was slow, with complete association requiring about 1 h. At 37 degrees C, a 21-mer oligomer bound weakly to the target duplex but both a 25-mer and the 30-mer readily formed a triplex. This relationship of triplex formation with length was temperature dependent, as at 25 degrees C the 21-mer behaved similarly to the longer oligomers. Increasing spermine concentrations (from 0.2 to 1 mM) increased the amount of triplex formed. Spermine may be important only for the association of the oligomer to the duplex, since decreasing the spermine concentration after the triplex formed did not reduce the amount of triplex detected. At 1 mM spermine, formation of the triple-helical complex was very dependent on the concentration of KCl; increasing the KCl from 50 to 100 mM prevented triplex formation. However, the inhibitory effect of KCl could be abrogated by raising the spermine concentration to 2 mM. Our observations indicate that a triple helix can form under physiologic conditions but its formation is affected by several competing interactions.