定量的ヒドロキシルラジカルフットプリントによる単一残基の空間およびミリ秒の時間分解能を持つ核酸の構造変化の監視

ヒドロキシルラジカル（.OH）フットプリントは、高分子の折りたたみ、相互作用、リガンド結合に関連する構造変化に関する包括的な部位固有の定量情報を提供します。「Fast Fenton」フットプリントは、DNAとRNAに容易に適用できるミリ秒の時間分解能が可能な時間分解フットプリントの実験室ベースの方法です。このプロトコルは、安価な化学試薬（H2O2、Fe（NH4）2（SO4）2、EDTA、チオウレアまたはエタノール）と広く利用可能なクエンチフローミキサーを利用して、一時的でしばしば短命の複雑な生化学プロセスの中間状態を明らかにします。特定のアプリケーションに容易に調整できるRNA折りたたみを研究するために開発されたプロトコルについて説明します。クエンチフローミキサーの動作とそのキャリブレーション、核酸標識、用量反応実験の実施に精通したら、30時点の単一の運動実験では約1時間かかります。.OH反応生成物のサンプル処理と分離には数時間かかります。データ分析は、実施された分析の深さに応じて、45分から数週間かかる場合があります。

Hydroxyl radical (.OH) footprinting provides comprehensive site-specific quantitative information about the structural changes associated with macromolecular folding, interactions and ligand binding. 'Fast Fenton' footprinting is a laboratory-based method for time-resolved .OH footprinting capable of millisecond time resolution readily applicable to DNA and RNA. This protocol utilizes inexpensive chemical reagents (H2O2, Fe(NH4)2(SO4)2, EDTA, thiourea or ethanol) and widely available quench-flow mixers to reveal transient, often short-lived, intermediate states of complex biochemical processes. We describe a protocol developed to study RNA folding that can be readily tailored to particular applications. Once familiar with quench-flow mixer operation and its calibration, nucleic acid labeling and the conduct of a dose-response experiment, a single kinetic experiment of 30 time points takes about 1 h to perform. Sample processing and separation of the .OH reaction products takes several hours. Data analysis can take 45 min to several weeks depending on the depth of analysis conducted.