非精神病末端の結合に対するLIGD（ヒトLIG4ホモログ）の欠陥は、Aspergillus oryzaeの遺伝子ターゲットの効率を大幅に改善する

相同組換えによる遺伝子ターゲットは、アスペルギルス・オリザエでは、相同性の組換えが支配的であるため、形質転換中はめったに起こりません。A. oryzaeの非常に効率的な遺伝子ターゲティングシステムを開発するために、DNA非母性末端結合の最終ステップに関与するヒトDNAリガーゼIVホモログをコードする遺伝子（LIGD）を抱える破壊された株を構築しました。A. oryzae ligd破壊薬は、栄養成長および/または分生子に明らかな欠陥を示さず、高濃度のメチルメタンスルホン酸塩に対する感度の増加を示し、野生型株と比較して二本鎖DNA休憩を引き起こしますが、メタンスルホン酸エチルおよびフレマイシンではありません。。Aspergillus nidulans SC遺伝子を選択可能なマーカーとして使用して、細胞外タンパク質分解遺伝子を調節する転写因子をコードする遺伝子であるPRTRの遺伝子補充は、LIGD破壊の遺伝子ターゲット効率の100％をもたらしました。使用された相同隣接シーケンスの長さが0.5 kbより長い野生型。同様に、遺伝子ターゲティング効率は、アスパラギン酸プロテアーゼをコードする遺伝子（PEPA）で100％と高かった。さらに、A。oryzaeのこのLigd破壊システムを使用して、5つのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）遺伝子を混乱させることに成功しました。このような結果は、LIGD破壊剤システムがA. oryzaeでの遺伝子ターゲットの非常に便利な遺伝的背景であることを示しています。

Gene-targeting by homologous recombination occurs rarely during transformation since nonhomologous recombination is predominant in Aspergillus oryzae. To develop a highly efficient gene-targeting system for A. oryzae, we constructed disrupted strains harboring a gene (ligD) encoding human DNA ligase IV homolog that is involved in the final step of DNA nonhomologous end joining. The A. oryzae ligD disruptants showed no apparent defect in vegetative growth and/or conidiation, and exhibited increased sensitivity to high concentration of methyl methansulfonate causing double-stranded DNA breaks compared with that of wild-type strain, but not to ethyl methanesulfonate and phleomycin. Gene replacement of the prtR, a gene encoding a transcription factor which regulates extracellular proteolytic genes, using the Aspergillus nidulans sC gene as the selectable marker resulted in 100% of gene-targeting efficiency in the ligD disruptant, compared to less than 30% for a wild-type, when the length of the homologous flanking sequences used was longer than 0.5 kb. Similarly, gene-targeting efficiency was as high as 100% for aspartic protease-encoding gene (pepA). Furthermore, using this ligD disruptant system of A. oryzae, we readily succeeded in disrupting five mitogen-activated protein kinase (MAPK) genes, namely mpkA, mpkB, hogA, mpkC and A. oryzae unique MAPK (mpkD). Such results show that the ligD disruptant system is an extremely convenient genetic background for gene-targeting in A. oryzae.