16S RRNA遺伝子ベースのPCRプライマーとの真核生物DNAの協調性：複雑な微生物群集の集団フィンガープリンティングの可能性のある結果

この研究の主な目的は、真核生物DNAで汚染されたサンプルの細菌群集分析のために、一般的に使用される3つの16S RRNA遺伝子ベースのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーセットの特異性を評価することでした。16S RRNA遺伝子のV3、V3-V5、およびV6-V8の過可視領域を標的とするプライマーセットの特異性は、シリコで、およびヒトおよび魚の腸のサンプルのコミュニティフィンガープリントによって調査されました。シリコとPCRベースの分析の両方で、ヒトおよびチョウザメの18S RRNA遺伝子を伴うV3およびV3-V5プライマーの交差反応性が明らかになりました。このプライマー異常の結果は、ヒト糞とシベリアのチョウザメの混合腸における微生物群集の変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）プロファイリングによって示されました。DGGEプロファイリングは、非標的真核生物DNAを使用した16S RRNA遺伝子プライマーの交差反応性が、細菌の生物多様性の過大評価につながる可能性があることを示しました。この研究では、一般的に適用されるいくつかの16S rRNA遺伝子プライマーセットが真核生物DNAの存在下で細菌に対する特異性を欠いていることを示す文献の以前の散発的な適応症を確認しました。交差反応性の現象は、クローニングとシーケンスによる個々のコミュニティアンプリコンのその後の分析が実行されないすべての生物多様性研究における系統的誤差の潜在的な原因です。

The main aim of this study was to evaluate the specificity of three commonly used 16S rRNA gene-based polymerase chain reaction (PCR) primer sets for bacterial community analysis of samples contaminated with eukaryotic DNA. The specificity of primer sets targeting the V3, V3-V5, and V6-V8 hypervariable regions of the 16S rRNA gene was investigated in silico and by community fingerprinting of human and fish intestinal samples. Both in silico and PCR-based analysis revealed cross-reactivity of the V3 and V3-V5 primers with the 18S rRNA gene of human and sturgeon. The consequences of this primer anomaly were illustrated by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) profiling of microbial communities in human feces and mixed gut of Siberian sturgeon. DGGE profiling indicated that the cross-reactivity of 16S rRNA gene primers with nontarget eukaryotic DNA might lead to an overestimation of bacterial biodiversity. This study has confirmed previous sporadic indications in literature indicating that several commonly applied 16S rRNA gene primer sets lack specificity toward bacteria in the presence of eukaryotic DNA. The phenomenon of cross-reactivity is a potential source of systematic error in all biodiversity studies where no subsequent analysis of individual community amplicons by cloning and sequencing is performed.