ホルマリン固定のパラフィン包埋組織におけるマイクロRNA発現分析のための総RNA抽出方法の評価と検証

よく承認されたホルマリン固定のパラフィン包埋（FFPE）組織標本の組織病理学アーカイブは、ヒト疾患の遡及的研究にとって貴重なリソースです。分子技術と互換性のある品質の無傷のmRNAの回復は、分解のためにしばしば困難であるため、FFPEサンプルの遺伝子発現研究の代替分析物として、治療および診断の可能性が高まっている小型RNA分子の新規クラスであるMicroRNA（miRNA）を評価しました。miRNA、mRNA、およびRRNA種のリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応の総RNA収量、miRNA回復、および堅牢性を分析すると、市販のRNA分離キットの性能を比較し、好ましい方法論を特定しました。さらに、組織のスループットを増やし、定量的な装甲RNAプロセス制御を組み込んでRNA回復効率を監視するための修正を実装しました。最適化されたプロセスは、再現性、相互術後および日中変動についてテストされ、30の臨床サンプルのセットで検証されました。さらに、FFPEブロックの年齢とRNA品質とは無関係に、miRNAは、より堅牢で、より堅牢で凍結参照サンプルの発現レベルとより良い相関がある定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応シグナルを生成することを実証しました。私たちの広範な研究は、17の組織タイプと12年前の65 FFPEブロックからの合計272の独立したRNA分離を含む、miRNAが適切であるだけでなく、妥協したアーカイブ臨床標本の分子特性の優れた分析物である可能性が高いことを示しています。

Histopathology archives of well-annotated formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue specimens are valuable resources for retrospective studies of human diseases. Since recovery of quality intact mRNA compatible with molecular techniques is often difficult due to degradation, we evaluated microRNA (miRNA), a novel class of small RNA molecules with growing therapeutic and diagnostic potential, as an alternative analyte for gene expression studies of FFPE samples. Analyzing total RNA yield, miRNA recovery, and robustness of real-time polymerase chain reaction for miRNA, mRNA, and rRNA species, we compared the performance of commercially available RNA isolation kits and identified a preferred methodology. We further implemented modifications to increase tissue throughput and incorporate a quantitative Armored RNA process control to monitor RNA recovery efficiency. The optimized process was tested for reproducibility as well as interoperator and interday variability, and was validated with a set of 30 clinical samples. In addition, we demonstrated that, independent of FFPE block age and RNA quality, miRNAs generate quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction signals that are more robust and better correlate with expression levels from frozen reference samples compared with longer mRNAs. Our broad study, including a total of 272 independent RNA isolations from 17 tissue types and 65 FFPE blocks up to 12 years old, indicates that miRNAs are not only suitable but are also likely superior analytes for the molecular characterization of compromised archived clinical specimens.