チオレドキシンA活性部位変異体は、酵素 - 副基地反応中間体に似た混合ジスルフィドダイマーを形成します

チオレドキシンは、サイトゾル内の主要なチオールジスルフィド酸化還元酵素として、ほぼすべての生物で機能します。その主な目的は、ジスルフィド交換反応で分子内ジスルフィド結合をジチオールに変換することにより、還元状態のシステイン含有タンパク質を維持することです。チオレドキシンは、異なる細胞タイプの特定の基質セットと相互作用することにより、さまざまな生理機能に寄与することが報告されています。低GCグラム陽性細菌菌液における必須チオレドキシンA（TRXA）の機能を調査するために、CXXC活性の2つのシステイン残基の1つまたは両方を欠く野生型TRXAおよび3つの変異TRXAタンパク質を精製しましたサイト。純粋なタンパク質は、共有ジスルフィド結合反応中間体を視覚化できる「混合ジスルフィド漁業」として知られる基質結合研究に使用されました。前例のない発見は、他の活性部位システインが存在しない場合、両方の活性部位システイン残基が基質タンパク質と混合ジスルフィドを形成できることですが、N末端活性部位システインのみが安定した相互作用を形成します。2番目の斬新なことは、両方のシングルシステイン変異体TrxAタンパク質が、残りの活性サイトシステイン残基のチオール酸化により安定したホモダイマーを形成することです。これらの二量体が混合酵素 - 副基地ジスルフィドに似ているかどうかを調査するために、最も豊富な二量体C32の構造は、X線結晶学によって特徴付けられました。これにより、低GCグラム陽性菌からチオレドキシンホモダイマーの高解像度（1.5a）X線結晶構造が得られました。C32S TRXAダイマーは、チオレドキシンの混合ジスルフィド反応中間体と見なすことができ、チオレドキシン/基質結合モードの多様性を明らかにします。

Thioredoxin functions in nearly all organisms as the major thiol-disulfide oxidoreductase within the cytosol. Its prime purpose is to maintain cysteine-containing proteins in the reduced state by converting intramolecular disulfide bonds into dithiols in a disulfide exchange reaction. Thioredoxin has been reported to contribute to a wide variety of physiological functions by interacting with specific sets of substrates in different cell types. To investigate the function of the essential thioredoxin A (TrxA) in the low-GC Gram-positive bacterium Bacillus subtilis, we purified wild-type TrxA and three mutant TrxA proteins that lack either one or both of the two cysteine residues in the CxxC active site. The pure proteins were used for substrate-binding studies known as "mixed disulfide fishing" in which covalent disulfide-bonded reaction intermediates can be visualized. An unprecedented finding is that both active-site cysteine residues can form mixed disulfides with substrate proteins when the other active-site cysteine is absent, but only the N-terminal active-site cysteine forms stable interactions. A second novelty is that both single-cysteine mutant TrxA proteins form stable homodimers due to thiol oxidation of the remaining active-site cysteine residue. To investigate whether these dimers resemble mixed enzyme-substrate disulfides, the structure of the most abundant dimer, C32S, was characterized by X-ray crystallography. This yielded a high-resolution (1.5A) X-ray crystallographic structure of a thioredoxin homodimer from a low-GC Gram-positive bacterium. The C32S TrxA dimer can be regarded as a mixed disulfide reaction intermediate of thioredoxin, which reveals the diversity of thioredoxin/substrate-binding modes.