インフルエンザAウイルス逆遺伝学のための単純化された組換えアプローチ

インフルエンザAウイルス（FLUAV）逆遺伝学には、制限酵素切断と結紮を使用して、8つのウイルスゲノムセグメントすべてをゲノム発現プラスミドにクローニングする必要があります。ここでは、プラスミドベクターのペアの構築と、逆遺伝学のためのインフルエンザcDNAとの直接組換えのためのReca Escherichia coliでの使用について説明します。このアプローチはより簡単です。ゲノムセグメントの必要な方向を維持しながら、制限消化と結紮を回避します。この組換えアプローチのために、2つのプラスミド構築物、Phh21aとPhh21gが生成されました。どちらも、負の鎖のコンセンサス5 'および3'端をStui Cleavage部位で分割した25ヌクレオチド組換えカセットを持っていますが、それは位置4から異なります。ゲノムセグメント間の違いに対応するAまたはGヌクレオチド（プラス感覚）の存在による3 '端。説明された手順を使用して、いくつかの鳥類およびヒト液のウイルスcDNAゲノムを単一の組換えステップでゲノム発現プラスミドにクローンすることができました。逆の遺伝学のためのゲノムプラスミド構造のセットを生成するこの新しいアプローチは、処置の時間と複雑さを減らし、ワクチンの生成または生物学的特性と分析のためのウイルスゲノムの救助を遅らせる合併症を回避します。

Influenza A virus (FLUAV) reverse genetics requires the cloning of all eight viral genome segments into genomic expression plasmids using restriction enzyme cleavage and ligation. Herein is described the construction of a pair of plasmid vectors and their use in RecA Escherichia coli for direct recombination with influenza cDNA for reverse genetics. This approach is simpler; avoiding restriction digestion and ligation while maintaining the required orientation of genome segments. For this recombinational approach two plasmid constructs were generated, pHH21A and pHH21G, that both possess a 25 nucleotide recombination cassette comprised of the consensus 5' and 3' ends of the negative strand divided by a StuI cleavage site, but that differ at position 4 from the 3' end due to the presence of an A or G nucleotide (plus sense) to correspond to differences among genome segments. Using the described procedure it was possible to clone viral cDNA genomes of several avian and human FLUAVs into genomic expression plasmids in a single recombination step. This novel approach to generating sets of genomic plasmid constructs for reverse genetics reduces the time and complexity of procedures thus avoiding complications that would delay rescue of viral genomes for vaccine production or biological characterization and analysis.