シロイヌナズナの根の幹細胞ニッチにおける核DNA含有量の新しい全マウントDNA定量化法と分析

いくつかの細胞層で構成される無傷の臓器や組織のオブジェクトの蛍光強度を定量化するための半自動方法が設計されています。この方法は、個々の核のDNA含有量を定量化できる全マウントヨウ化物プロピジウム染色シロイヌナズナ（シロイヌナズナ）の根の先端で開発されています。直径150 microM未満であるため、この臓器は全マウントイメージングに最適です。さらなる利点は、クロロフィルと透明な細胞壁の欠如であり、背景蛍光は少ししかありません。この方法は、核の位置に関する情報が維持され、異常なDNA含有量を持つ核を個別に再評価することができるため、フローサイトメトリーよりも大きな利点があり、技術的アーティファクトと異常なDNA含有量の間の効率的な区別を促進します。平均3Dメソッドは、核のすべてのセクションの合計された蛍光強度の平均を計算し、欠落しているセクションを補間し、それにより検出問題の修正を可能にします。さらに、この方法には、複数の細胞層をカバーする組織内のオブジェクトを検出するという利点があります。シロイヌナズナの根の先端における我々の方法の結果は、めったに分裂することはない静止中心細胞が二倍体であり、G1またはG0で逮捕されていることを示した。血管組織のものを除くほとんどの幹細胞は二倍体細胞であり、それらの除算率はかなり低いG1相によって引き起こされます。対照的に、血管幹細胞の大部分は四倍体です。

A semi-automated method to quantify fluorescence intensity of objects in intact organs and tissues, composed of several cell layers, has been designed. The method has been developed on whole-mount propidium-iodide stained Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) root tips, in which the DNA content of individual nuclei could be quantified. A diameter of less than 150 microm makes this organ most appropriate for whole-mount imaging. Further advantages are the lack of chlorophyll and transparent cell walls, with only a little background fluorescence. The method has a great advantage over flow cytometry, as the information regarding the positions of nuclei is maintained, and nuclei with aberrant DNA content can be re-assessed individually, which facilitates the efficient distinction between technical artefact and aberrant DNA content. Our averaging 3D method calculates the average of the summed fluorescence intensities of all sections of a nucleus and interpolates the missing sections, thereby allowing for the correction of detection problems. Furthermore, this method has the advantage of detecting objects in tissues covering multiple cell layers. The results of our method in Arabidopsis root tips showed that the quiescent centre cells, which rarely divide, are diploid, and are arrested in G1 or G0. Most stem cells, with the exception of those of the vascular tissue, are diploid cells, and their rather low division rate is caused by an elongated G1 phase. In contrast, the majority of the vascular stem cells are tetraploid.