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蛍光相関分光法（FCS）の修正バージョンは、同様の拡散係数を持つ分子の混合物の場合に使用される光子カウントヒストグラム（PCH）メソッドに密接に関連しています。染色テトラメチルホダミンエチルエステル、TMRE、エネルギー化された状態と不機嫌な状態の両方でミトコンドリアを分離します。異なる強度のピークシーケンスを表すTMREドープミトコンドリアの懸濁液の蛍光時間痕跡は、蛍光ビーズとTMREドープラテックス粒子のものと類似しているように見えました。実験データは、攪拌条件下で得られ、イベントの数を約3桁増加させるため、メソッドの解像度を大幅に強化しました。共焦点を反映する同一の蛍光粒子の明るさの統計は、TMREドープミトコンドリアのピーク強度分析（PIA）を実行できるようにする単純な分析方程式によって説明されました。PIAの妥当性は、さまざまなサイズの蛍光ビーズとTMREドープラテックス粒子でテストされました。TMREの存在下でのミトコンドリアのエネルギーは、蛍光時間痕跡のピークの数と強度の増加をもたらし、そのPIAにより、ミトコンドリア膜電位、さらに多くのミトコンドリア粒子が懸濁液1 mlあたりのミトコンドリア粒子を決定することができました。単一のミトコンドリアの膜電位の値は、ミトコンドリア懸濁液に関連するデータと一致して約180 mVと推定されました。重要なことに、PIA法では、測定ごとに1マイクログラムのミトコンドリアタンパク質が必要でした。
蛍光相関分光法（FCS）の修正バージョンは、同様の拡散係数を持つ分子の混合物の場合に使用される光子カウントヒストグラム（PCH）メソッドに密接に関連しています。染色テトラメチルホダミンエチルエステル、TMRE、エネルギー化された状態と不機嫌な状態の両方でミトコンドリアを分離します。異なる強度のピークシーケンスを表すTMREドープミトコンドリアの懸濁液の蛍光時間痕跡は、蛍光ビーズとTMREドープラテックス粒子のものと類似しているように見えました。実験データは、攪拌条件下で得られ、イベントの数を約3桁増加させるため、メソッドの解像度を大幅に強化しました。共焦点を反映する同一の蛍光粒子の明るさの統計は、TMREドープミトコンドリアのピーク強度分析（PIA）を実行できるようにする単純な分析方程式によって説明されました。PIAの妥当性は、さまざまなサイズの蛍光ビーズとTMREドープラテックス粒子でテストされました。TMREの存在下でのミトコンドリアのエネルギーは、蛍光時間痕跡のピークの数と強度の増加をもたらし、そのPIAにより、ミトコンドリア膜電位、さらに多くのミトコンドリア粒子が懸濁液1 mlあたりのミトコンドリア粒子を決定することができました。単一のミトコンドリアの膜電位の値は、ミトコンドリア懸濁液に関連するデータと一致して約180 mVと推定されました。重要なことに、PIA法では、測定ごとに1マイクログラムのミトコンドリアタンパク質が必要でした。
A modified version of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) closely related to the photon counting histogram (PCH) method, which is used in the case of a mixture of molecules with similar diffusion coefficients, was applied here for analyzing the binding of the potential-sensitive dye tetramethylrhodamine ethyl ester, TMRE, to isolated mitochondria both in energized and deenergized states. Fluorescence time traces of suspensions of TMRE-doped mitochondria representing sequences of peaks of different intensity appeared to be similar to those of fluorescent beads and TMRE-doped latex particles. The experimental data were obtained under stirring conditions which increased the number of events by about three orders of magnitude thus substantially enhancing the resolution of the method. The statistics of the brightness of identical fluorescent particles reflecting their random walk through the confocal volume was described by a simple analytical equation which enabled us to perform the peak intensity analysis (PIA) of TMRE-doped mitochondria. The validity of PIA was tested with fluorescent beads of different sizes and TMRE-doped latex particles. Mitochondrial energization in the presence of TMRE led to the increase in the number and the intensity of the peaks in fluorescence time traces, the PIA of which allowed us to determine mitochondrial membrane potential and additionally a number of mitochondrial particles per ml of the suspension. The value of the membrane potential on a single mitochondrion was estimated to be about 180 mV in agreement with the data related to mitochondrial suspensions. Importantly, the PIA method required less than 1 microgram of mitochondrial protein per measurement.
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