ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）GAG、POL、およびENVタンパク質の発現Chimeric HIV-1-Poliovirus Minireplicons

最近の研究では、P1（CapSID）領域の欠失を伴うポリオウイルスのゲノムには、RNA複製に必要なウイルス情報が含まれていることが実証されています。RNA複製とタンパク質発現に対する外来遺伝子の置換の効果をテストするために、キメラヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1） - ポリオウイルスゲノムが構築され、HIV-1のGAG、POL、またはENV遺伝子の領域が構築されました。1型Mahoney Poliovirusの感染性cDNAクローンのP1遺伝子の領域に置き換えられます。HIV-1遺伝子は、ポリオウイルスcDNAのヌクレオチド1174と2956の間に挿入され、HIV-1遺伝子と残りのポリオウイルス遺伝子の間で翻訳読み取りフレームが維持されました。キメラゲノムは、T7 RNAポリメラーゼプロモーターから下流に配置され、T7 RNAポリメラーゼを使用してin vitroで転写され、RNAをHELA細胞にトランスフェクトしました。トランスフェクトされた細胞からのRNAの北（RNAブロット）分析により、適切なサイズのRNAが実証されており、全長のキメラゲノムに対応し、時間とともに増加しました。エイズ患者からのポリオウイルスRNAポリメラーゼまたは血清に特異的な抗体による免疫沈降は、ポリオウイルスP1タンパク質の融合としてのポリオウイルスRNAポリメラーゼおよびHIV-1タンパク質の発現を示しました。HIV-1-ポリオウイルスP1融合タンパク質の発現は、無傷のRNAポリメラーゼ遺伝子に依存しており、効率的な発現にRNA複製が必要であることを示しています。キメラゲノムからのタンパク質発現のパルスチェース分析は、トランスフェクトされた細胞にHIV-1-ポリオウイルスP1融合タンパク質を与えるために、キメラゲノムからポリタンパク質の初期迅速なタンパク質分解プロセシングを示しました。HIV-1 GAG-P1およびHIV-1 POL-P1融合タンパク質は、HIV-1 ENV-P1融合タンパク質よりも大きな細胞内安定性を示しました。最後に、キメラゲノムをトランスフェクトしていたHeLa細胞の野生型ポリオウイルスを伴う重複感染は、キメラ融合タンパク質の発現に有意に影響しませんでした。結果は、ポリオウイルスRNA複製のコンテキストで議論され、外来タンパク質の発現の新規ベクターとしてポリオウイルスゲノム（ミニレプリコン）を使用する可能性を示しています。

Recent studies have demonstrated that genomes of poliovirus with deletions in the P1 (capsid) region contain the necessary viral information for RNA replication. To test the effects of the substitution of foreign genes on RNA replication and protein expression, chimeric human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-poliovirus genomes were constructed in which regions of the gag, pol, or env gene of HIV-1 were substituted for regions of the P1 gene in the infectious cDNA clone of type 1 Mahoney poliovirus. The HIV-1 genes were inserted between nucleotides 1174 and 2956 of the poliovirus cDNA so that the translational reading frame was maintained between the HIV-1 genes and the remaining poliovirus genes. The chimeric genomes were positioned downstream from a T7 RNA polymerase promoter and transcribed in vitro by using T7 RNA polymerase, and the RNA was transfected into HeLa cells. A Northern (RNA blot) analysis of the RNA from transfected cells demonstrated the appropriate-size RNA, corresponding to the full-length chimeric genomes, which increased over time. Immunoprecipitation with antibodies specific for poliovirus RNA polymerase or sera from AIDS patients demonstrated the expression of the poliovirus RNA polymerase and HIV-1 proteins as fusions with the poliovirus P1 protein. The expression of the HIV-1-poliovirus P1 fusion protein was dependent upon an intact RNA polymerase gene, indicating that RNA replication was required for efficient expression. A pulse-chase analysis of the protein expression from the chimeric genomes demonstrated the initial rapid proteolytic processing of the polyprotein from the chimeric genomes to give HIV-1-poliovirus P1 fusion protein in transfected cells; the HIV-1 gag-P1 and HIV-1 pol-P1 fusion proteins exhibited a greater intracellular stability than the HIV-1 env-P1 fusion protein. Finally, superinfection with wild-type poliovirus of HeLa cells which had been transfected with the chimeric genomes did not significantly affect the expression of chimeric fusion protein. The results are discussed in the context of poliovirus RNA replication and demonstrate the feasibility of using poliovirus genomes (minireplicons) as novel vectors for expression of foreign proteins.