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細菌で発現する組換えタンパク質の迅速かつ効率的な精製を可能にするために、いくつかのシステムが開発されています。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を含むフレーム内のポリペプチドの発現により、グルタチオンアガロースのアフィニティクロマトグラフィーによる非変性条件下での粗細菌抽出物からの融合タンパク質の精製が可能になります（D. B. Smith and K. S. Johnson、1988、Gene 67、31-40）。このベクター発現システムには、細菌融合タンパク質のタンパク質分解を促進するために、特定のプロテアーゼ切断部位が組み込まれています。私たちの手では、トロンビン切断部位でのこれらの融合タンパク質の切断がゆっくりと進行しました。融合タンパク質の切断を促進するために、トロンビン切断部位の直後にあるシーケンスP.G.I.S.G.G.G.G.Gを含むグリシンリッチリンカー（グリシンキンカー）を導入しました。このグリシンキンカーは、いくつかの融合タンパク質のトロンビン切断効率を大幅に増加させます。グリシンキンカーを融合タンパク質に導入すると、アフィニティ樹脂に付着している間に融合タンパク質の切断を可能にし、組換えタンパク質の単一のステップ精製をもたらします。タンパク質チロシンホスファターゼをテストタンパク質として使用した数時間以内に、2 mg以上の高精製タンパク質が数時間以内に100 mLの細菌培養物に相当するものから得られました。ベクターであるPGEX-KGは、すべての読み取りフレームでさまざまなcDNAのクローニングを促進するために修正されており、いくつかの真核生物タンパク質を発現するために成功裏に使用されています。
細菌で発現する組換えタンパク質の迅速かつ効率的な精製を可能にするために、いくつかのシステムが開発されています。グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を含むフレーム内のポリペプチドの発現により、グルタチオンアガロースのアフィニティクロマトグラフィーによる非変性条件下での粗細菌抽出物からの融合タンパク質の精製が可能になります（D. B. Smith and K. S. Johnson、1988、Gene 67、31-40）。このベクター発現システムには、細菌融合タンパク質のタンパク質分解を促進するために、特定のプロテアーゼ切断部位が組み込まれています。私たちの手では、トロンビン切断部位でのこれらの融合タンパク質の切断がゆっくりと進行しました。融合タンパク質の切断を促進するために、トロンビン切断部位の直後にあるシーケンスP.G.I.S.G.G.G.G.Gを含むグリシンリッチリンカー（グリシンキンカー）を導入しました。このグリシンキンカーは、いくつかの融合タンパク質のトロンビン切断効率を大幅に増加させます。グリシンキンカーを融合タンパク質に導入すると、アフィニティ樹脂に付着している間に融合タンパク質の切断を可能にし、組換えタンパク質の単一のステップ精製をもたらします。タンパク質チロシンホスファターゼをテストタンパク質として使用した数時間以内に、2 mg以上の高精製タンパク質が数時間以内に100 mLの細菌培養物に相当するものから得られました。ベクターであるPGEX-KGは、すべての読み取りフレームでさまざまなcDNAのクローニングを促進するために修正されており、いくつかの真核生物タンパク質を発現するために成功裏に使用されています。
Several systems have been developed to allow for rapid and efficient purification of recombinant proteins expressed in bacteria. The expression of polypeptides in frame with glutathione S-transferase (GST) allows for purification of the fusion proteins from crude bacterial extracts under nondenaturing conditions by affinity chromatography on glutathione agarose (D. B. Smith and K. S. Johnson, 1988, Gene 67, 31-40). This vector expression system has also incorporated specific protease cleavage sites to facilitate proteolysis of the bacterial fusion proteins. In our hands, the cleavage of these fusion proteins at a thrombin cleavage site proceeded slowly. To facilitate the cleavage of fusion proteins, we have introduced a glycine-rich linker (glycine kinker) containing the sequence P.G.I.S.G.G.G.G.G located immediately following the thrombin cleavage site. This glycine kinker greatly increases the thrombin cleavage efficiency of several fusion proteins. The introduction of the glycine kinker into fusion proteins allows for the cleavage of the fusion proteins while they are attached to the affinity resin resulting in a single step purification of the recombinant protein. More than 2 mg of the highly purified protein was obtained from the equivalent of 100 ml of bacterial culture within a few hours when a protein tyrosine phosphatase was employed as a test protein. The vector, pGEX-KG, has also been modified to facilitate cloning of a variety of cDNAs in all reading frames and has been successfully used to express several eukaryotic proteins.
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