TOC-GTPaseホモダイマーの重要性について

外側葉緑体膜を横切る前駆体タンパク質転座は、受容体成分を認識するGTPaseを含むTOC複合体の作用に依存します。GTPaseのgドメインは二量体になることが知られています。二量体の立体構造では、アルギニンがトランスの結合ヌクレオチドのリン酸部分に接触します。速度論的研究では、アルギニン自体が相互のGTPase活性化タンパク質（GAP）のアルギニン指として作用しないことが示唆されました。ここでは、2つのGTPaseホモログの残基の特定の機能を調査します。アルギニンからアラニン補充バリアントは、野生型GTPaseと比較して、二量体化の親和性を大幅に減少させました。アミノ酸交換は、2.0aのシロイヌナズナToC33アルギニン - アルニン - アラニン置換バリアントのモノマーX線結晶構造に見られるように、全体的な折り畳みおよびヌクレオチド結合に影響を与えません。NMRと分析的超遠心分離を使用して、遷移状態アナログGDP/ALF（X）で触媒中心を調査しました。ALF（X）結合はアルギニンに依存しており、ホモダイマーの非GAP性質にもかかわらず、残基が触媒に役割を果たすことができることを示唆しています。2つの非独占的な機能モデルについて説明します。1）COGAP仮説では、追加因子がGTPaseをホモダイマー形式で活性化します。2）タンパク質、おそらく大きなTOC159 GTPaseがホモダイマーサブユニットの1つと交換し、活性化につながるスイッチ仮説。

Precursor protein translocation across the outer chloroplast membrane depends on the action of the Toc complex, containing GTPases as recognizing receptor components. The G domains of the GTPases are known to dimerize. In the dimeric conformation an arginine contacts the phosphate moieties of bound nucleotide in trans. Kinetic studies suggested that the arginine in itself does not act as an arginine finger of a reciprocal GTPase-activating protein (GAP). Here we investigate the specific function of the residue in two GTPase homologues. Arginine to alanine replacement variants have significantly reduced affinities for dimerization compared with wild-type GTPases. The amino acid exchange does not impact on the overall fold and nucleotide binding, as seen in the monomeric x-ray crystallographic structure of the Arabidopsis Toc33 arginine-alanine replacement variant at 2.0A. We probed the catalytic center with the transition state analogue GDP/AlF(x) using NMR and analytical ultracentrifugation. AlF(x) binding depends on the arginine, suggesting the residue can play a role in catalysis despite the non-GAP nature of the homodimer. Two non-exclusive functional models are discussed: 1) the coGAP hypothesis, in which an additional factor activates the GTPase in homodimeric form; and 2) the switch hypothesis, in which a protein, presumably the large Toc159 GTPase, exchanges with one of the homodimeric subunits, leading to activation.