マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを使用した定量的画像ベースのアポトーシス指数測定：標準的な測光法との比較

顕微鏡による形態学的特性評価は、核凝縮、核断片化、膜ブレビングなどの特性を使用して、アポトーシス細胞を正確に識別するためのゴールドスタンダードのままです。ただし、顕微鏡を使用したアポトーシス形態の定量的測定には時間がかかり、客観性と再現性が不足している可能性があり、大きな集団の微妙な変化を特定することが困難です。したがって、サンプルのアポトーシス指数は、TUNEL（末端デオキシヌクレオチドトランスフェーゼDUTPニック標識）アッセイなどの二次マーカーを使用してアポトーシスの特徴を標的とするさまざまな蛍光強度ベース（光メトリック）アッセイを使用したフローサイトメトリーによって一般的に測定されます。断片化、表面ホスファチジルセリン（PS）暴露のためのアネキシンVアッセイ、およびカスパーゼ活性化を検出するための蛍光カスパーゼ基質。ここでは、画像上のマルチスペクトルイメージングサイトメーターによって流れで収集された多数の画像に関する自動画像分析を使用して、核凝縮、核断片化、および膜ブレビングに基づいたアポトーシスの正確な定量化のための新しい方法を提示します。さらに、核断片化の測定は、時間の経過に伴うアポトーシスの二次的な検出方法と相関しており、アポトーシスの初期マーカーでもあることを示しています。各光メトリックフローサイトメトリーベースの方法に関連する偽陽性および偽陰性イベントは定量化されており、必要に応じて自動的に削除/含めることができます。多数の細胞でのマルチスペクトル画像の獲得は、アポトーシスのより完全かつ堅牢な分析を可能にする形態ベースのアルゴリズムの精度を備えたフローサイトメトリーの定量的利点をカップルします。

Morphological characterization by microscopy remains the gold standard for accurately identifying apoptotic cells using characteristics such as nuclear condensation, nuclear fragmentation, and membrane blebbing. However, quantitative measurement of apoptotic morphology using microscopy can be time consuming and can lack objectivity and reproducibility, making it difficult to identify subtle changes in large populations. Thus the apoptotic index of a sample is commonly measured by flow cytometry using a variety of fluorescence intensity based (photometric) assays which target hallmarks of apoptosis with secondary markers such as the TUNEL (Terminal Deoxynucleotide Transferase dUTP Nick End Labeling) assay for detection of DNA fragmentation, the Annexin V assay for surface phosphatidylserine (PS) exposure, and fluorogenic caspase substrates to detect caspase activation. Here a novel method is presented for accurate quantitation of apoptosis based on nuclear condensation, nuclear fragmentation, and membrane blebbing using automated image analysis on large numbers of images collected in flow by the ImageStream multispectral imaging cytometer. Additionally the measurement of nuclear fragmentation correlates with the secondary methods of detection of apoptosis over time, indicating that it is also an early marker for apoptosis. False-positive and false-negative events associated with each photometric flow cytometry based method are quantitated and can be automatically removed/included where appropriate. Acquisition of multi-spectral imagery on large numbers of cells couples the quantitative advantage of flow cytometry with the accuracy of morphology-based algorithms allowing more complete and robust analysis of apoptosis.