リゾチーム再訪：部位Dに結合したN-アセチルムラミン酸残基の歪みの結晶学的証拠

三糖2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ミュラミン酸ベータ（1 ---- 4）-2-アセトアミド-2-デオキシ-D-グルコースベータ（1 ---- 4） - の構造鶏の卵白リゾチームの活性部位裂のサブサイトB、C、およびDに結合した2-アセトアミド-2-デオキシ-D-ムラミン酸（NAM-NAG-NAM）は、1.5 Aの解像度で測定され、洗練されています。得られた原子座標は、部位DのNAM残基が完全な4C1椅子の立体構造から、リング原子C-1、C-2、O-5、およびC-5がほぼ副次的であり、ヒドロキシメチル基は軸方向に配置されています（ソファとして最もよく説明されている立体構造）。この発見は、部位Dの砂糖の基底状態の立体構造が、反応経路に沿った次のステップであるオキソカルボニウムイオン遷移状態に必要なジオメトリにもっとよく似たものに緊張していることを示唆する元の提案を支持しています。さらに、1.5での詳細な分析触媒残基Glu35およびASP52の環境の解像度は、リゾチームが異常に長寿命のオキソカルボニウムイオン遷移状態の安定化を促進できるようにする特性に関する新しい情報を提供します。部位DのN-アセチルムラミン酸残基と、糖化環の歪みに寄与するリゾチーム分子との間の分子間相互作用には、酵素残基の水素結合「プラットフォーム」を備えたO-3 'ラクチル基の密接な梱包（ASP52、ASN46、ASN59、Ser50およびASP48）、リングDのヒドロキシメチル基とリングCの2'-Acetamidoグループとの間の密接な接触、および安定化するリングDのVAL109とO-6の強力な水素結合相互作用-CH2OHグループの観測された準軸方向。さらに、この複合体の構造は、Glu35のカルボキシル基と部位DのNAM残基のベータアノマーヒドロキシル基との間に強い水素結合を示しています。潜在的なカルボキシレート求核剤のアプローチの非常に好ましくない方向は、雌鶏卵白リゾチームの加水分解経路に共有グリコシル酵素中間体があることはほとんどありそうにありません。

A structure of the trisaccharide 2-acetamido-2-deoxy-D-muramic acid-beta (1----4)-2-acetamido-2-deoxy-D-glucose-beta (1----4)-2-acetamido-2-deoxy-D-muramic acid (NAM-NAG-NAM), bound to subsites B, C and D in the active-site cleft of hen egg-white lysozyme has been determined and refined at 1.5 A resolution. The resulting atomic co-ordinates indicate that the NAM residue in site D is distorted from the full 4C1 chair conformation to one in which the ring atoms C-1, C-2, O-5 and C-5 are approximately coplanar, and the hydroxymethyl group is positioned axially (a conformation best described as a sofa). This finding supports the original proposals that suggested the ground-state conformation of the sugar bound in site D is strained to one that more closely resembles the geometry required for the oxocarbonium-ion transition state, the next step along the reaction pathway. Additionally, detailed analysis at 1.5 A resolution of the environments of the catalytic residues Glu35 and Asp52 provides new information on the properties that may allow lysozyme to promote the stabilization of an unusually long-lived oxocarbonium-ion transition state. Intermolecular interactions between the N-acetylmuramic acid residue in site D and the lysozyme molecule that contribute to the saccharide ring distortion include: close packing of the O-3' lactyl group with a hydrogen-bonded "platform" of enzyme residues (Asp52, Asn46, Asn59, Ser50 and Asp48), a close contact between the hydroxymethyl group of ring D and the 2'-acetamido group of ring C and a strong hydrogen-bonded interaction between the NH group of Val109 and O-6 of ring D that stabilizes the observed quasi-axial orientation of the -CH2OH group. Additionally, the structure of this complex shows a strong hydrogen bond between the carboxyl group of Glu35 and the beta-anomeric hydroxyl group of the NAM residue in site D. The hydrogen-bonded environment of Asp52 in the native enzyme and in the complex coupled with the very unfavorable direction of approach of the potential carboxylate nucleophile makes it most unlikely that there is a covalent glycosylenzyme intermediate on the hydrolysis pathway of hen egg-white lysozyme.