抑制機能の細分化機能：DNA結合親和性、選択性、およびアロステリーは、LACI/GALRホモログ内の非保存残基のアミノ酸置換によって変化する可能性があります

タンパク質機能に影響を与える多くの変異は、リガンドに直接接触しない残基で発生します。LACI/GALRホモログのDNA結合および調節ドメインをリンクする配列からの機能的寄与を理解するために、LACI DNA結合ドメイン、Laciリンカー、およびPurrを含むキメラタンパク質（LLHP）を作成しました。規制ドメイン。DNA結合部位残基はLLHPとLACIで同一ですが、DNA結合親和性の熱力学的測定は、LLHPが代替DNAリガンドとLACIを識別しないことを示しています。さらに、小角散乱実験により、LLHPはLACIよりもコンパクトであることが示されています。DNAが放出されると、LACIは、以前はリンカーの展開に起因していた20の長さの増加を示しています。2つのタンパク質のリンカー配列が同一であるにもかかわらず、この変化はApo-llHPでは見られません。合わせて、結果は、長距離の機能的および構造的変化が、リンカーと調節ドメインの間に形成される界面全体に伝播されることを示しています。これらの変化は、天然のタンパク質であるLACIおよびPURRの調節ドメインに接触するいくつかのリンカー残基の側鎖を介して媒介する可能性があります。LLHPのこれらの残基の置換は、さまざまな機能効果をもたらします。4つのバリアントは、選択性またはアロステリック応答に変化がなく、DNAに対する親和性の変化を示します。別の2つの結果は、LACI結合非特異的DNA配列と同様に、非常に低い親和性とアロステリック反応を持たないオペレーターDNAを結合するタンパク質になります。さらに2つの置換が同時に親和性を低下させ、アロステリーを強化し、DNAリガンド選択性を大きく変化させます。したがって、リンカー内の位置を変化させて、リプレッサー関数のさまざまな側面を調節できます。

Many mutations that impact protein function occur at residues that do not directly contact ligand. To understand the functional contributions from the sequence that links the DNA-binding and regulatory domains of the LacI/GalR homologues, we have created a chimeric protein (LLhP), which comprises the LacI DNA-binding domain, the LacI linker, and the PurR regulatory domain. Although DNA binding site residues are identical in LLhP and LacI, thermodynamic measurements of DNA binding affinity show that LLhP does not discriminate between alternative DNA ligands as well as LacI. In addition, small-angle scattering experiments show that LLhP is more compact than LacI. When DNA is released, LacI shows a 20 A increase in length that was previously attributed to unfolding of the linker. This change is not seen in apo-LLhP, even though the linker sequences of the two proteins are identical. Together, results indicate that long-range functional and structural changes are propagated across the interface that forms between the linker and regulatory domain. These changes could be mediated via the side chains of several linker residues that contact the regulatory domains of the naturally occurring proteins, LacI and PurR. Substitution of these residues in LLhP leads to a range of functional effects. Four variants exhibit altered affinity for DNA, with no changes in selectivity or allosteric response. Another two result in proteins that bind operator DNA with very low affinity and no allosteric response, similar to LacI binding nonspecific DNA sequences. Two more substitutions simultaneously diminish affinity, enhance allostery, and profoundly alter DNA ligand selectivity. Thus, positions within the linker can be varied to modulate different aspects of repressor function.