mRNAキャッピング酵素の小さな干渉RNAノックダウンによる哺乳類細胞におけるアポトーシスとオートファジー誘導

酵母から哺乳類への真核生物の前mRNA処理の最初のステップであるRNAポリメラーゼII転写産物への5 'キャップの添加は、RNAトリホスファターゼ、グアニラ-N-7）メチルトランスフェラーゼの連続的な作用によって触媒されます。哺乳類細胞におけるこれらのキャッピング酵素のノックダウンの効果は、T7 RNAポリメラーゼ同様の小さな干渉RNAとレンチウイルスベースの誘導性の短いヘアピンRNAシステムを使用して調査されました。グアニリルトランスフェラーゼまたはメチルトランスフェラーゼのいずれかを減らすと、カスパーゼ-3の活性化と末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介Dutp-ビオチンニック末端標識（TUNEL）染色特性がアポトーシスの特性を挙げました。アポトーシスの誘導は、p53腫瘍抑制因子とは無関係でしたが、BakまたはBaxに依存していました。さらに、BH3ファミリーメンバーのBIMのレベルは増加しましたが、MCL-1およびBIKレベルはアポトーシス中は変化しませんでした。キャッピング酵素ノックダウンとは対照的に、タンパク質合成のシクロヘキシミド阻害によって誘発されるアポトーシスは、BAXではなくBAKを必要としませんでした。BIMとMCl-1の両方のレベルは、シクロヘキシミド誘発性アポトーシスで減少しましたが、BIKレベルは変化しませんでした。これは、siRNA処理細胞のアポトーシスがmRNA翻訳の喪失の直接的な結果ではないことを示唆しています。siRNA処理BAK（ - / - ）BAX（ - / - ）ダブルノックアウトマウス胚性線維芽細胞は、カパゼ-3を活性化したり、TUNEL染色を増加させたりすることができませんでしたが、オートファジーを示しました。細胞質構造。

Addition of a 5' cap to RNA polymerase II transcripts, the first step of pre-mRNA processing in eukaryotes from yeasts to mammals, is catalyzed by the sequential action of RNA triphosphatase, guanylyltransferase, and (guanine-N-7)methyltransferase. The effects of knockdown of these capping enzymes in mammalian cells were investigated using T7 RNA polymerase-synthesized small interfering RNA and also a lentivirus-based inducible, short hairpin RNA system. Decreasing either guanylyltransferase or methyltransferase resulted in caspase-3 activation and elevated terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) staining characteristic of apoptosis. Induction of apoptosis was independent of p53 tumor suppressor but dependent on BAK or BAX. In addition, levels of the BH3 family member Bim increased, while Mcl-1 and Bik levels remained unchanged during apoptosis. In contrast to capping enzyme knockdown, apoptosis induced by cycloheximide inhibition of protein synthesis required BAK but not BAX. Both Bim and Mcl-1 levels decreased in cycloheximide-induced apoptosis while Bik levels were unchanged, suggesting that apoptosis in siRNA-treated cells is not a direct consequence of loss of mRNA translation. siRNA-treated BAK(-/-) BAX(-/-) double-knockout mouse embryonic fibroblasts failed to activate capase-3 or increase TUNEL staining but instead exhibited autophagy, as demonstrated by proteolytic processing of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and translocation of transfected green fluorescent protein-LC3 from the nucleus to punctate cytoplasmic structures.