イノシンをプライマーに導入する効果の定量的PCR測定は、縮退したプライマー設計を改善するためのガイドラインを提供します

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、グループ固有の縮退プライマーを使用してウイルスのグループを検出するために使用されます。イノシン残基は、補完的な標的配列内のさまざまな位置に一致するためにプライマーで使用されることがありますが、cDNA合成と増幅に対する影響に関するデータはほとんどありません。定量的逆転写PCRを使用して、異なる位置と増加する数に置換されたイノシン残基を含むプライマーで増幅速度を測定しました。実験は、クローンDNAから転写されたジャガイモyゲノムRNAおよびRNA（CRNA）からコピーされたクローンDNAの標準量を使用して実施されました。単一のイノシン残基は、3 '末端に近い1つの位置を除き、順方向プライマーの増幅速度に影響を与えませんでした。逆に、単一のイノシン残基は、リバースプライマーの4つの位置のうち3位に配置すると、増幅速度を大幅に減少させました。4つまたは5つのイノシン置換は、いくらかの速度の低下で許容される可能性がありますが、増幅は、より多くのイノシンを含むプライマーを備えたCRNAテンプレートからしばしば失敗しました。RNAテンプレートでは、増幅速度の大幅な減少が観察され、イノシンがリバースプライマーに含まれる場合、逆転写がPCR増幅を超えることを示唆しています。

Polymerase chain reaction (PCR) is used to detect groups of viruses with the use of group-specific degenerate primers. Inosine residues are sometimes used in the primers to match variable positions within the complementary target sequences, but there is little data on their effects on cDNA synthesis and amplification. A quantitative reverse-transcription PCR was used to measure the rate of amplification with primers containing inosine residues substituted at different positions and in increasing numbers. Experiments were conducted using standard quantities of cloned DNA copied from Potato virus Y genomic RNA and RNA (cRNA) transcribed from the cloned DNA. Single inosine residues had no affect on the amplification rate in the forward primer, except at one position close to the 3' terminus. Conversely, single inosine residues significantly reduced the amplification rate when placed at three out of four positions in the reverse primer. Four or five inosine substitutions could be tolerated with some decline in rates, but amplification often failed from cRNA templates with primers containing larger numbers of inosines. Greater declines in the rate of amplification were observed with RNA templates, suggesting that reverse transcription suffers more than PCR amplification when inosine is included in the reverse primer.