システインの架橋形成228-チロシン272ガラクトースオキシダーゼの触媒補因子は、二酸化生物を必要としません

ガラクトースオキシダーゼ（GO）は、活性部位アミノ酸からのレドックス活性補因子のアセンブリを自己触媒するタンパク質のクラスに属します。酵素的にアクティブなGOの生成は、少なくとも4つの連続した翻訳後修飾を必要とするように見えます：分泌シグナル配列の切断、N末端プロの配列の銅依存性切断、C228-Y272チオエーテル結合の銅依存性形成、および発電Y272ラジカルの。最後の2つのプロセスは、PROシーケンスを欠く切り捨てられたタンパク質（延期GOと呼ばれる）を使用して調査され、銅のない条件下で精製されました。Cu（II）との延期の反応は、光学、EPR、および共鳴ラマン分光法、SDS-PAGE、およびX線結晶構造を使用して調査されました。延期は、過剰なCu（II）で嫌気的に反応して、Y272ラジカルではなく、チオエーテル結合を効率的に形成しました。C228-Y272クロスリンクをまだ形成していない処理反応における潜在的なC228コッパー調整中間体（lambda max = 406 nm）は、吸収スペクトルから識別されました。C228、H496、およびH581に調整された銅 - チオ酸タンパク質複合体は、X線結晶構造によって3分間の嫌気性浸漬で観察されましたが、24時間のSOAKはC228-Y272チオエーテル結合を明らかにしました。溶液では、過剰なCu（II）でプレインキュベートした延長に酸素化された緩衝液を添加すると、Y272ラジカル状態が生成されました。これらのデータに基づいて、C228-Y272結合とチロシルラジカル生成の形成のメカニズムが提案されています。406 nm複合体は、嫌気性条件下で触媒的に有能な加工中間体であることが実証されています。2番目の電子受容体が必要なステップまで、Cu（II）による好気性処理と共通する潜在的なメカニズムを提案します。

Galactose oxidase (GO) belongs to a class of proteins that self-catalyze assembly of their redox-active cofactors from active site amino acids. Generation of enzymatically active GO appears to require at least four sequential post-translational modifications: cleavage of a secretion signal sequence, copper-dependent cleavage of an N-terminal pro sequence, copper-dependent formation of a C228-Y272 thioether bond, and generation of the Y272 radical. The last two processes were investigated using a truncated protein (termed premat-GO) lacking the pro sequence and purified under copper-free conditions. Reactions of premat-GO with Cu(II) were investigated using optical, EPR, and resonance Raman spectroscopy, SDS-PAGE, and X-ray crystallography. Premat-GO reacted anaerobically with excess Cu(II) to efficiently form the thioether bond but not the Y272 radical. A potential C228-copper coordinated intermediate (lambda max = 406 nm) in the processing reaction, which had not yet formed the C228-Y272 cross-link, was identified from the absorption spectrum. A copper-thiolate protein complex, with copper coordinated to C228, H496, and H581, was also observed in a 3 min anaerobic soak by X-ray crystallography, whereas a 24 h soak revealed the C228-Y272 thioether bond. In solution, addition of oxygenated buffer to premat-GO preincubated with excess Cu(II) generated the Y272 radical state. On the basis of these data, a mechanism for the formation of the C228-Y272 bond and tyrosyl radical generation is proposed. The 406 nm complex is demonstrated to be a catalytically competent processing intermediate under anaerobic conditions. We propose a potential mechanism which is in common with aerobic processing by Cu(II) until the step at which the second electron acceptor is required.