LC-ESI-MS/MSによる生物学的サンプルにおける重要な調節オキシステロールの高感度の定量化

生物学的サンプルにおける主要な調節オキシステロールを定量化するための非常に敏感で特異的な方法について説明します。この方法は、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）による安定した同位体希釈技術に基づいています。ヒト血清（5ミクロール）またはラット肝臓ミクロソーム（1 mgタンパク質）のアルカリ加水分解の後、オキシステロールを抽出し、ピコリニルエステルに誘導し、エレクトロスプレーイオン化モードを使用してLC-MS/MSによって分析しました。4beta-ヒドロキシコレステロール、7alpha-ヒドロキシコレステロール、22R-ヒドロキシコレステロール、24S-ヒドロキシコレステロール、25-ヒドロキシコレステロール、27-ヒドロキシコレスロール、25-エポキソレスエステル、25-エポキシロエステロール、25-エポキシロエステロール、25-ヒドロキシコレステロール、25-ヒドロキシコレステロール、25-ヒドロキシコレステロール、25-エポキシロエステルのピコリニルエステルの検出限界amol）on-column（信号対雑音比= 3）。これらのオキシステロールの再現性と回復は、それぞれ一元配置レイアウトと多項式方程式に従って検証されました。サンプル製剤間とこの方法による測定間の違いは、それぞれ1.8％から12.7％、2.9％から11.9％であると計算されました。回収実験は、0.05 ngから12 ngのオキシテロールでスパイクされたラット肝臓ミクロソームを使用して実施され、オキシステロールの回収率は86.7％から107.3％の範囲で、平均回収率は100.6％でした。この方法は、少量の生物学的サンプルでのオキシステロールの定量化のための再現性のある信頼できる結果を提供します。

We describe a highly sensitive and specific method for the quantification of key regulatory oxysterols in biological samples. This method is based upon a stable isotope dilution technique by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). After alkaline hydrolysis of human serum (5 microl) or rat liver microsomes (1 mg protein), oxysterols were extracted, derivatized into picolinyl esters, and analyzed by LC-MS/MS using the electrospray ionization mode. The detection limits of the picolinyl esters of 4beta-hydroxycholesterol, 7alpha-hydroxycholesterol, 22R-hydroxycholesterol, 24S-hydroxycholesterol, 25-hydroxycholesterol, 27-hydroxycholesterol, and 24S,25-epoxycholesterol were 2-10 fg (5-25 amol) on-column (signal-to-noise ratio = 3). Reproducibilities and recoveries of these oxysterols were validated according to one-way layout and polynomial equation, respectively. The variances between sample preparations and between measurements by this method were calculated to be 1.8% to 12.7% and 2.9% to 11.9%, respectively. The recovery experiments were performed using rat liver microsomes spiked with 0.05 ng to 12 ng of oxysterols, and recoveries of the oxysterols ranged from 86.7% to 107.3%, with a mean recovery of 100.6%. This method provides reproducible and reliable results for the quantification of oxysterols in small amounts of biological samples.