ヒト細胞株のアセチルコリン受容体の抗原調節を検出するための迅速で蛍光ベースのアッセイ

背景：Gravis筋膜（Mg）は、米国の約40,000人の患者に影響を与える自己免疫疾患です。MGにおける疾患病理学の主要なメカニズムの1つは、ACHR特異的自己抗体を架橋することにより、神経筋接合部でのアセチルコリン受容体（ACHR）の結合、内在化、および最終的な破壊です。抗原調節として知られるこのプロセスは、最終的にニューロンからのシグナルに応じて収縮する筋肉細胞の能力を弱め、筋肉の衰弱と疲労につながります。このため、培養細胞上のACHRの抗原調節は、ACHR特異的自己抗体の病原性を評価するための重要な診断ツールになりました。伝統的に、これらのアッセイは、（125）I alpha-bungarotoxinなどの放射性標識ACHRリガンドを使用して行われており、相対ACHR数を決定していました。ここでは、細胞表面のACHRレベルを定量化し、抗原変調を救うために設計された分子の有効性を評価するために使用できる高スループット免疫蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイを提示します。 方法：ACHRモノクローナル抗体、MAB210およびMAB B3による免疫蛍光標識を介してACHR抗体による治療前後のヒト筋肉細胞でACHRレベルを定量化し、それに続いてEDTA処理細胞のフローサイトメトリーを使用しました。 結果：ACHR特異的モノクローナル抗体とMg患者血清の両方を使用して、Human細胞でACHRの抗原調節を実証した新規のフローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました。抗原調節の程度は、抗体レベルに反応する用量であり、可溶性ACHRアルファサブユニット細胞外ドメインとプレインキュベートすることにより逆転する可能性があります。 概要：Mg患者の血清におけるACHR特異的抗体の可能性を決定するために、ACHRをバインドおよびダウンレギュレートするために、迅速で非放射性アッセイが開発されました。このアッセイは、抗原調節を救い、Mgの治療のために開発できる推定治療能力の能力を評価するために使用できます。

BACKGROUND: Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease affecting approximately 40,000 patients in the United States. One of the major mechanisms of disease pathology in MG is the binding, internalization, and eventual destruction of acetylcholine receptors (AChR) at the neuromuscular junction by cross-linking AChR-specific autoantibodies. This process, known as antigenic modulation, ultimately attenuates the ability of muscle cells to contract in response to signals from neurons, leading to muscle weakness and fatigue. For this reason, antigenic modulation of the AChR on cultured cells has become an important diagnostic tool for assessing the pathogenicity of AChR-specific autoantibodies. Traditionally, these assays have been done using radiolabeled AChR ligands such as (125)I alpha-bungarotoxin to determine relative AChR number. Here, we present a high-throughput immunofluorescent flow cytometry-based assay that can be used to quantify AChR levels on the cell surface and assess the efficacy of molecules designed to rescue antigenic modulation. METHODS: AChR levels were quantified on human muscle cells before and after treatment with AChR antibodies via immunofluorescent labeling with the AChR monoclonal antibodies, mAb210 and mAb B3, followed by flow cytometry of EDTA-treated cells. RESULTS: Using a novel, flow cytometry-based assay, antigenic modulation of the AChR was demonstrated on human cells using both AChR-specific monoclonal antibody and MG patient serum. The degree of antigenic modulation was dose responsive to antibody levels and could be reversed by preincubating antibodies with soluble AChR alpha subunit extracellular domain. SUMMARY: A rapid, nonradioactive assay was developed to determine the potential of AChR-specific antibodies in the serum of MG patients to bind and down-regulate the AChR. This assay can be used to assess the ability of putative therapeutics that rescue antigenic modulation and could be developed for the treatment of MG.