Fusarium oxysporumのアグロバクテリア媒介形質転換：挿入変異誘発と遺伝子導入のための効率的なツール

要約Agrobacterium Tumefaciensを介した形質転換（ATMT）は、遺伝子を多種多様な植物に移すために長い間使用されており、挿入変異誘発のための効率的なツールとしても機能しています。この論文では、真菌変換のための4つの新規バイナリベクターの構築と、フザリウムオキシソポラムおよび他の植物病原性真菌の効率的な遺伝的操作を可能にする挿入変異誘発のためのATMTプロトコルの最適化を報告します。バイナリベクターを使用して、選択可能なマーカーとしてアスペルギルスnidulans TRPCプロモーターの制御下にある細菌のヒグロマイシンBホスホトランズ - リソーゼ遺伝子（HPH）を運ぶため、1 x 10（6）あたり300〜500ヒグロマイシンB耐性形質転換体が生成されました。F. oxysporumの分生子は、以前に達成されたものよりも少なくとも1桁高いです。形質転換効率は、アグロバクテリウムツメファシエンス細胞と真菌胞子の共栽培の持続時間と強く相関し、共栽培期間中に存在するアグロバクテリウムツメファシエン細胞の数と有意に相関していました（r = 0.996; n = 3; p <0.01）。テストされたすべての形質転換体は、ハイグロマイシンB耐性を維持し、陽性的に安定したままでした。アセトシリンゴンの存在下でアグロバクテリウムツメファシアン細胞を成長させる前に（AS）、形質転換体の形成に必要な時間が短縮されましたが、ゲノムごとの単一のT-DNA挿入物を含む形質転換体の割合を53％に減らしました。Agrobacterium Tumefaciens細胞が使用されていない場合に成長した場合、これは80％以上に増加しました。ゲノムあたりのT-DNAの平均コピー数と形質転換体のコロニー直径、共栽培期間または共栽培中に存在するアグロバクテリウムチューメファシエン細胞の量との間に相関はありませんでした。挿入されたT-DNAに隣接する宿主シーケンスを分離するために、修正された熱非対称インターレースPCR（Tail-PCR）技術を採用しました。任意のプライマーのみを使用すると、分析されたこれらの形質転換体の90％で希望の生成物が増幅されました。挿入イベントは、サイズが1から14 bpの範囲の挿入されたT-DNAの切り捨てによるランダムなプロセスであり、右側と左の境界シーケンスの両方で発生します。ここで説明するベクターのサイズと設計を考慮して、このATMTプロトコルの効率と柔軟性と相まって、ATMTは、Fの病原性に重要な遺伝子を特徴付ける他のDNA転移手順の非常に効率的な代替手順と見なされるべきであることが示唆されています。。oxysporumおよび潜在的に他の真菌病原体。

ABSTRACT Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT) has long been used to transfer genes to a wide variety of plants and has also served as an efficient tool for insertional mutagenesis. In this paper, we report the construction of four novel binary vectors for fungal transformation and the optimization of an ATMT protocol for insertional mutagenesis, which permits an efficient genetic manipulation of Fusarium oxysporum and other phytopathogenic fungi to be achieved. Employing the binary vectors, carrying the bacterial hygromycin B phosphotrans-ferase gene (hph) under the control of the Aspergillus nidulans trpC promoter as a selectable marker, led to the production of 300 to 500 hygromycin B resistant transformants per 1 x 10(6) conidia of F. oxysporum, which is at least an order of magnitude higher than that previously accomplished. Transformation efficiency correlated strongly with the duration of cocultivation of fungal spores with Agrobacterium tumefaciens cells and significantly with the number of Agrobacteruium tumefaciens cells present during the cocultivation period (r = 0.996; n = 3; P < 0.01). All transformants tested remained mitotically stable, maintaining their hygromycin B resistance. Growing Agrobacterium tumefaciens cells in the presence of acetosyringone (AS) prior to cocultivation shortened the time required for the formation of transformants but decreased to 53% the percentage of transformants containing a single T-DNA insert per genome. This increased to over 80% when Agrobacterium tumefaciens cells grown in the absence of AS were used. There was no correlation between the average copy number of T-DNA per genome and the colony diameter of the transformants, the period of cocultivation or the quantity of Agrobacterium tumefaciens cells present during cocultivation. To isolate the host sequences flanking the inserted T-DNA, we employed a modified thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR) technique. Utilizing just one arbitrary primer resulted in the successful amplification of desired products in 90% of those transformants analyzed. The insertion event appeared to be a random process with truncation of the inserted T-DNA, ranging from 1 to 14 bp in size, occurring on both the right and left border sequences. Considering the size and design of the vectors described here, coupled with the efficiency and flexibility of this ATMT protocol, it is suggested that ATMT should be regarded as a highly efficient alternative to other DNA transfer procedures in characterizing those genes important for the pathogenicity of F. oxysporum and potentially those of other fungal pathogens.