液体クロマトグラフィー・安定同位体比タンデム質量分析法による黒色腫細胞中の5'-デオキシ-5'-メチルチオアデノシンの定量分析

メチルチオアデノシンホスホリラーゼ (MTAP) 遺伝子を含むヒト染色体領域 9p21 の頻繁な欠失は、がん細胞における 5'-デオキシ-5'-メチルチオアデノシン (MTA) の細胞内および/または細胞外蓄積と、その後の腫瘍進行の促進につながると仮説が立てられています。腫瘍細胞における MTA を直接測定するための感度の高い方法論が存在しないため、これまでこの仮説の検証が妨げられてきました。液体クロマトグラフィー エレクトロスプレー イオン化タンデム質量分析法 (LC-MS/MS) は、内部標準として安定同位体標識 MTA を使用して、細胞培養培地および細胞抽出物中の MTA を絶対定量するために開発されました。検出限界 (LOD) と定量下限 (LLOQ) はそれぞれ 62.5 pM と 2 nM であり、事前の濃縮なしで生体サンプル中の MTA を直接測定することができました。細胞および細胞培地からの MTA 抽出、および LC-MS/MS 分析の平均不精度は、それぞれ 9.7、3.8、および 1.9% でした。この方法により、黒色腫細胞培養培地中の MTA の蓄積が 24 時間以内に定常状態レベルに達することを実証することができました。MTAP発現のある細胞とない細胞の間では、細胞外MTA濃度のわずかな差のみが観察されました。しかし、MTAPを欠く黒色腫細胞では細胞内MTA濃度が4倍増加し、染色体9p21欠失を有するヒト癌細胞におけるMTAの蓄積という仮説が裏付けられた。

The frequent deletion of the human chromosomal region 9p21, including the methylthioadenosine phosphorylase (MTAP) gene, is hypothesized to lead to the intra- and/or extracellular accumulation of 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine (MTA) in cancer cells and the subsequent promotion of tumor progression. The lack of sensitive methodology for the direct measurement of MTA in tumor cells has hampered the testing of this hypothesis to date. A liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry method (LC-MS/MS) was developed for the absolute quantitative determination of MTA in cell culture media and cell extracts using stable isotope labeled MTA as an internal standard. Limit of detection (LOD) and lower limit of quantification (LLOQ) were 62.5 pM and 2 nM, respectively, and allowed the direct measurement of MTA in biological samples without prior enrichment. Average imprecision of MTA extraction from cells and cell media, as well as LC-MS/MS analysis were 9.7, 3.8 and 1.9%, respectively. The method enabled the demonstration of the accumulation of MTA in melanoma cell culture media reaching a steady-state level within 24h. Only a slight difference in extracellular MTA concentrations was observed between cells with and without MTAP expression. However, there was a fourfold increase in intracellular MTA concentration in melanoma cells lacking MTAP, thus confirming the hypothesized accumulation of MTA in human cancer cells harboring a chromosome 9p21 deletion.