NS0細胞培養用の動物のないタンパク質を含まない化学的に定義された培地の開発

市場でモノクローナル抗体の最近のブームがあり、それらのかなりの部分がNS0細胞株によって生成されました。生産プロセスが不定のエージェントによる潜在的な汚染がないことを保証するために規制がより厳しくなるにつれて、動物の起源または「動物のない培地」のコンポーネントを含まないものに血清を含まない培地をさらに開発することが非常に望ましい。シェークフラスコバッチ培養システムを使用して、組換えタンパク質（ヒトアルブミンとヒトインスリン）と合成化合物（トロポロンおよび鉄クエン酸アンモニウム）を使用して、NS0細胞の血清を含まない培地で一般的に発見された動物型のタンパク質を置き換えることができると特定されました。培養、すなわちウシアルブミン、インスリン、トランスフェリン。NS0細胞のコレステロール要件は、ウシのリポタンパク質の代わりに市販の非タンパク質、非動物源コレステロール/脂肪酸混合物を使用することで満たされました。このように配合された動物を含まない培地では、宿主または組換えコンストラクトのいずれかであるNS0細胞株はすべて、複数の通路でバッチ培養で1〜3x10（6）生存可能な細胞/mlに成長することができました。10％の血清含有培養物から播種した場合。組換えインスリンが亜鉛塩と比較してナトリウム塩として本質的に効果がないことを観察するのは驚くべきことでした。研究では、前者の亜鉛欠乏が細胞の生存率の急速な低下をもたらしたことが示されました。亜鉛イオンの補給は成長を大幅に改善し、組換えインスリンの総置換、したがってタンパク質を含まない培地の製剤さえもたらしました。細胞株がコレステロールに依存しない成長に適応し、脂質源の必要性を排除すると、完全に化学的に定義された動物を含まない培地が処方されました。すべての場合において、動物を含まない培地のさまざまなGS-NS0コンストラクトによる抗体産生は、複数の箇所で安定しており、少なくとも動物ソースのタンパク質を含む元の血清を含まない培地に類似していました。培地は、血清の非存在下でのNS0細胞の凍結保存にも役立ちました。

There has been a recent boom of monoclonal antibodies on the market, and a significant portion of them were produced by NS0 cell lines. As regulations become more stringent in ensuring production processes are free of potential contamination by adventitious agents, it is highly desirable to further develop serum-free media into ones that do not contain any components of animal origin, or 'animal-free media'. Using a shake-flask batch culture system, recombinant proteins (human albumin and human insulin) and synthetic compounds (tropolone and ferric ammonium citrate) were identified to be capable of replacing the animal-sourced proteins commonly found in serum-free media for NS0 cell culture, namely bovine albumin, insulin and transferrin. The cholesterol requirement of NS0 cells was satisfied by the use of a commercially available non-proteinaceous, non-animal sourced cholesterol/fatty acid mix in place of bovine lipoproteins, which in effect also eliminated the need for recombinant albumin. In the animal-free medium thus formulated, NS0 cell lines, either the host or recombinant constructs, were all able to grow in batch culture to 1~ 3x10(6) viable cells/ml for multiple passages, with no requirement for gradual adaptation even when seeded from 10% serum-containing cultures. It was surprising to observe that the recombinant insulin was essentially ineffective as sodium salt compared to its zinc salt. Studies showed that the zinc deficiency in the former resulted in a rapid decline of cell viabilities. Supplementation of zinc ions greatly improved growth, and even led to the total replacement of recombinant insulin and hence the formulation of a protein-free medium. When the cell lines were adapted to cholesterol-independent growth which eliminated the need for any lipid source, a completely chemically-defined animal-free medium was formulated. In all cases, antibody production by various GS-NS0 constructs in animal-free media was stable for multiple passages and at least similar to the original serum-free medium containing the animal-sourced proteins. The medium also served well for cryopreservation of NS0 cells in the absence of serum.